旅順產(chǎn)白眉蝮蛇（Gloydius blomhoffi brevicaudus）蛇毒去整合素的提取與純化.pdf

1、去整合素 蛇毒因其廣泛的生物活性早已引起了國內(nèi)外科學(xué)工作者的注意。人們從蛇毒中提出了許多具有潛在臨床應(yīng)用前景的單一組分。其中，去整合素(disintegrins)為一組源自于出血性蛇毒的抗黏附多肽或蛋白質(zhì)的總稱，因其可強力拮抗整合素(integrin)而得名。其特征為富含半胱氨酸，并多含有Arg-Gly-Asp(RGD)或Lys-Gly-Asp(KGD)親水性氨基酸序列，分子量僅為5kD～9kD，多為單鏈多肽或蛋白分子。此蛇毒

2、蛋白家族可憑借其分子中RGD序列而成為細胞外基質(zhì)(ECM)與細胞整合素間結(jié)合的強有力的競爭性拮抗劑；因RGD模體能被血小板纖維蛋白原受體αⅡβ3識別，其還具有抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集的作用。因此，去整合素可運用于與細胞黏附相關(guān)的疾病研究領(lǐng)域，如血管新生、腫瘤轉(zhuǎn)移、血栓癥等。關(guān)于去整合素的功能研究，國內(nèi)外已有的相關(guān)報道為：臺灣的Rhodostomin[1]和Accutin[2]、韓國的Salmosin[3,4]和Saxatilin[5]

3、、美國的Contortrostatin[6]等，這些取自于蛇毒的去整合素均具有抑制血管新生與腫瘤轉(zhuǎn)移，抑制血小板聚集等功效[1-9]。 整合素為一細胞表面受體的異源二聚體家族，是一組跨膜糖蛋白。迄今為止，已知有18種不同的α亞基和8種不同的β亞基組成至少24種的異源二聚體[10-12]。α及β亞基的N末端(胞外端)共同構(gòu)成配體結(jié)合位點。因為大部分細胞整合素都識別RGD氨基酸順序，而大多數(shù)ECM蛋白都含有RGD順序，所以RGD序

4、列已被公認為是ECM成分與細胞整合素結(jié)合的位點[13]。整合素胞內(nèi)部分較短，但可以通過α-輔肌動蛋白(α-actinin)、踝蛋白(talin)和粘著斑蛋白(vinculin)與細胞骨架相連。整合素主要介導(dǎo)細胞之間及細胞與ECM之間的黏附，并介導(dǎo)細胞與ECM之間的雙向信號傳導(dǎo)，對細胞的黏附，增殖，分化，轉(zhuǎn)移，調(diào)亡起到重要的調(diào)控作用，在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[14]。 目前本實驗室已經(jīng)從產(chǎn)于中國旅順的白眉蝮蛇(Gloydi

5、us blomhohffibrevicaudus)毒腺中提取總RNA，利用自行設(shè)計的引物進行RT-PCR擴增，獲得了219bp的白眉蝮蛇去整合素基因。測序結(jié)果顯示，其與韓國的蝮蛇去整合素的saxatilin的同源性最高：DNA序列同源性為95.8％，蛋白質(zhì)序列同源性為91.8％，且蛋白質(zhì)中含有去整合素的特征模體RGD及12個半胱氨酸。本研究室將此去整合素基因進行克隆、轉(zhuǎn)化與誘導(dǎo)后，得到了該蛋白的可溶性高效表達。經(jīng)組氨酸親和層析純化，獲得

6、了分子量為9kD的均質(zhì)蛋白，將其命名為rAdinbitor。通過實驗證明，rAdinbitor能夠有效的抑制血小板的聚集，對腫瘤細胞轉(zhuǎn)移，浸潤和增殖也有明顯的抑制作用。 為了近一步比較白眉蝮蛇蛇毒中去整合素和rAdinbitor在結(jié)構(gòu)、功能方面的差同，完善本試驗室對蛇毒去整合素的制備工藝，本試驗嘗試從旅順產(chǎn)白眉蝮蛇蛇毒中進行去整合素的分離和純化。主要做了如下工作： 1)利用凝膠過濾與反相高效液相色譜對旅順產(chǎn)白眉蝮蛇蛇

7、毒去整合素進行純化，通過血小板凝集抑制試驗對各洗脫組分進行活性鑒定以確定去整合素所在組分。實驗結(jié)果表明，通過串聯(lián)凝膠過濾和反相高效液相色譜，得到了分離純化的白眉蝮蛇去整合素。Tricine SDS-PAGE電泳后銀染，呈現(xiàn)出兩條清晰、分離的蛋白條帶，分子量分別為12kD和17kD。 2)利用凝膠過濾和離子交換層析對旅順白眉蝮蛇去整合素進行純化，通過血小板凝集抑制試驗對各洗脫組分進行活性鑒定確定去整合素所在組分。實驗結(jié)果表明，通