瑞替加濱對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠的腦保護(hù)作用：下調(diào)calpain-1、Bax,上調(diào)Bcl-2的表達(dá).pdf

1、缺血性腦卒中是最常見的腦卒中類型，也是成人死亡和殘疾的主要原因之一。腦缺血后繼發(fā)性腦損傷是一個(gè)涉及炎癥、氧化應(yīng)激、鈣超載、興奮性氨基酸中毒、細(xì)胞凋亡等一系列復(fù)雜因素的級(jí)聯(lián)過(guò)程，這些因素相互影響，形成對(duì)腦組織的二次打擊，成為病情加重的主要原因。因此，若以上述級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)為靶點(diǎn)，抑制缺血半暗帶細(xì)胞的漸進(jìn)性死亡，可能發(fā)揮腦保護(hù)作用，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　瑞替加濱(retigabine,RTG)目前作為成人部分型癲癇發(fā)作的輔

2、助用藥，具有穩(wěn)定神經(jīng)元靜息膜電位、抗興奮性等特點(diǎn)。除了作為新型抗癲癇藥物，瑞替加濱對(duì)神經(jīng)性疼痛、神經(jīng)退行性病變、肌張力障礙等疾病也具有潛在的臨床治療價(jià)值，同時(shí)，在培養(yǎng)的海馬腦片上使用血清剝奪和血氧剝奪的方法，瑞替加濱可發(fā)揮抗氧化作用減少細(xì)胞的死亡。我們假設(shè)在缺血性腦卒中發(fā)生后瑞替加濱通過(guò)限制神經(jīng)元放電活動(dòng)保存細(xì)胞能量，減輕缺血情況下的腦損傷。
　　缺血性腦組織死亡方式除了細(xì)胞壞死還包括細(xì)胞凋亡。缺血性腦卒中發(fā)生后，損傷相對(duì)較輕的半

3、暗帶區(qū)域的細(xì)胞可能經(jīng)歷著由基因調(diào)控的自主有序的死亡，即細(xì)胞凋亡。氧化應(yīng)激損傷、過(guò)度炎癥反應(yīng)、谷氨酸大量釋放、鈣超載等均有可能觸發(fā)細(xì)胞凋亡信號(hào)使細(xì)胞產(chǎn)生“自殺”行為。凋亡的細(xì)胞在凋亡性核酸內(nèi)切酶的作用下細(xì)胞的 DNA被降解，形成凋亡小體。研究表明，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase）家族成員之一caspase-3是主要的凋亡“執(zhí)行者”，其活化后可以裂解多種

4、功能蛋白質(zhì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。缺血性腦卒中發(fā)生后 caspase在腦中的表達(dá)水平升高，抑制 caspase的活化可以減輕缺血性損傷發(fā)揮腦保護(hù)作用。
　　細(xì)胞凋亡的過(guò)程涉及到很多促凋亡相關(guān)因子的表達(dá)及抗凋亡相關(guān)因子的抑制。缺血性腦卒中發(fā)生后，促凋亡蛋白 Bax在腦中的表達(dá)水平升高。抑制 Bax或過(guò)表達(dá)抗凋亡蛋白 Bcl-2可以減輕缺血性損傷發(fā)揮腦保護(hù)作用。鈣蛋白酶（calpain）是一類鈣依賴的半胱氨酸肽鏈內(nèi)切酶的總稱，可以感受細(xì)胞內(nèi)升高

5、的鈣離子濃度而被激活，并通過(guò)多種途徑引起細(xì)胞凋亡。calpain還可以裂解抗凋亡蛋白 Bcl-2促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制calpain的活性也能發(fā)揮腦保護(hù)作用。
　　本研究采用健康成年雄性 CD-1小鼠為研究對(duì)象，通過(guò)線栓法建立小鼠永久性大腦中動(dòng)脈閉塞模型，給予瑞替加濱干預(yù)后，通過(guò)神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦梗死體積及腦組織含水量測(cè)定，觀察瑞替加濱對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠是否具有腦保護(hù)作用；通過(guò)測(cè)定小鼠缺血半暗帶細(xì)胞核 DNA斷裂的情況及 cleav

6、ed caspase-3的蛋白表達(dá)水平觀察瑞替加濱對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠腦組織凋亡的影響；通過(guò)測(cè)定小鼠缺血后腦皮層 Bax、calpain-1及 Bcl-2的表達(dá)情況觀察瑞替加濱對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠腦組織中促凋亡、抗凋亡因子的影響，探討其可能的相關(guān)作用機(jī)制，為瑞替加濱的進(jìn)一步研究及臨床應(yīng)用提供理論支持和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究分為三部分，各部分內(nèi)容概述如下。
　　第一部分瑞替加濱對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠的腦保護(hù)作用
　　目的：通過(guò)對(duì)瑞替加濱干預(yù)

7、后實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦梗死體積及腦組織含水量測(cè)定，觀察瑞替加濱對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠的腦保護(hù)作用。
　　方法：
　　1采用健康成年雄性 CD-1小鼠為研究對(duì)象，通過(guò)線栓法建立小鼠永久性大腦中動(dòng)脈閉塞模型。將 CD-1小鼠隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組（ Sham）、大腦中動(dòng)脈閉塞組（ MCAO）、瑞替加濱低劑量組（ RTG5）、瑞替加濱中劑量組（ RTG10）及瑞替加濱高劑量組（RTG20）。假手術(shù)組小鼠接受假手術(shù)操作

8、后1小時(shí)腹腔注射等量生理鹽水；大腦中動(dòng)脈閉塞組小鼠接受線栓法大腦中動(dòng)脈閉塞手術(shù)后1小時(shí)腹腔注射等量生理鹽水；瑞替加濱低劑量組小鼠接受線栓法大腦中動(dòng)脈閉塞手術(shù)后1小時(shí)腹腔注射瑞替加濱5mg/kg；瑞替加濱中劑量組小鼠接受線栓法大腦中動(dòng)脈閉塞手術(shù)后1小時(shí)腹腔注射瑞替加濱10mg/kg；瑞替加濱高劑量組小鼠接受線栓法大腦中動(dòng)脈閉塞手術(shù)后1小時(shí)腹腔注射瑞替加濱15mg/kg。各組小鼠于手術(shù)造模后24小時(shí)進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，2,3,5-氯化三苯

9、基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色測(cè)定腦梗死體積，干濕重法測(cè)定腦組織含水量。
　　2為進(jìn)一步探討瑞替加濱對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠的腦保護(hù)作用時(shí)間窗，我們也觀察了在腦缺血發(fā)生后不同時(shí)間給予瑞替加濱干預(yù)對(duì)小鼠缺血性腦損傷的影響。將 CD-1小鼠隨機(jī)分為5組：大腦中動(dòng)脈閉塞組（MCAO）、瑞替加濱缺血后即刻用藥組（RTG-0h）、瑞替加濱缺血后1小時(shí)用藥組(RTG-1h)、瑞替加濱缺

10、血后2小時(shí)用藥組（RTG-2h）、瑞替加濱缺血后3小時(shí)用藥組（RTG-3h）。大腦中動(dòng)脈閉塞組小鼠接受線栓法大腦中動(dòng)脈閉塞手術(shù)；瑞替加濱缺血后即刻用藥組小鼠接受線栓法大腦中動(dòng)脈閉塞手術(shù)后即刻腹腔注射瑞替加濱10mg/kg；瑞替加濱缺血后1小時(shí)用藥組小鼠接受線栓法大腦中動(dòng)脈閉塞手術(shù)后1小時(shí)腹腔注射瑞替加濱10mg/kg；瑞替加濱缺血后2小時(shí)用藥組小鼠接受線栓法大腦中動(dòng)脈閉塞手術(shù)后2小時(shí)腹腔注射瑞替加濱10mg/kg；瑞替加濱缺血后3小時(shí)用

11、藥組小鼠接受線栓法大腦中動(dòng)脈閉塞手術(shù)后3小時(shí)腹腔注射瑞替加濱10mg/kg；各組小鼠在不需要瑞替加濱干預(yù)的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均腹腔注射等量的生理鹽水。各組小鼠于手術(shù)造模后24小時(shí) TTC染色測(cè)定腦梗死體積。
　　結(jié)果：
　　1 Sham組小鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分均為0，MCAO組小鼠則明顯高于 Sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)；與 MCAO組小鼠相比， RTG5組和 RTG10組小鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)

12、意義（P<0.05)；RTG15組小鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分較MCAO組小鼠無(wú)明顯改變，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05)。
　　2 Sham組小鼠腦片 TTC染色后呈現(xiàn)均勻一致的紅色，MCAO組小鼠腦片 TTC染色后在右側(cè)皮層及基底節(jié)區(qū)呈現(xiàn)大范圍的白色梗死區(qū)域。與 MCAO組小鼠相比， RTG5組和 RTG10組小鼠的梗死體積明顯減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)；RTG15組小鼠的梗死體積較MCAO組小鼠無(wú)明顯改變，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意

13、義（P>0.05)。
　　3腦組織含水量測(cè)定結(jié)果顯示：與 MCAO組小鼠相比，RTG5組和RTG10組小鼠的腦組織含水量明顯減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P<0.05)；RTG15組小鼠的腦組織含水量較 MCAO組小鼠無(wú)明顯改變，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P>0.05)。上述結(jié)果表明瑞替加濱給藥劑量在5mg/kg、10mg/kg時(shí)均能夠較好的發(fā)揮腦保護(hù)作用，接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)我們將主要關(guān)注瑞替加濱在10mg/kg時(shí)的相關(guān)作用及機(jī)制。
　　4

14、與 MCAO組小鼠相比，RTG-0h組、RTG-1h組、RTG-2h組及RTG-3h組小鼠的梗死體積明顯減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)。RTG-0h組、RTG-1h組、RTG-2h組及RTG-h3組小鼠的梗死體積相互比較沒(méi)有明顯改變，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05)。上述結(jié)果表明瑞替加濱10mg/kg在缺血發(fā)生后0-3小時(shí)給藥均能發(fā)揮腦保護(hù)作用。
　　第二部分瑞替加濱對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠腦組織細(xì)胞凋亡的影響
　　目的：

15、通過(guò)測(cè)定小鼠缺血后半暗帶腦細(xì)胞核 DNA斷裂的情況及cleaved caspase-3的蛋白表達(dá)水平觀察瑞替加濱對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠腦細(xì)胞凋亡的影響。
　　方法：采用健康成年雄性 CD-1小鼠為研究對(duì)象，通過(guò)線栓法建立小鼠永久性大腦中動(dòng)脈閉塞模型。將 CD-1小鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組（ Sham）、大腦中動(dòng)脈閉塞組（ MCAO）、瑞替加濱干預(yù)組（RTG）。假手術(shù)組小鼠接受假手術(shù)操作后1小時(shí)腹腔注射等量生理鹽水；大腦中動(dòng)脈閉塞組小鼠

16、接受線栓法大腦中動(dòng)脈閉塞手術(shù)后1小時(shí)腹腔注射等量生理鹽水；瑞替加濱組小鼠接受線栓法大腦中動(dòng)脈閉塞手術(shù)后1小時(shí)腹腔注射瑞替加濱10mg/kg。各組小鼠于手術(shù)造模后24小時(shí)TUNEL試劑盒檢測(cè)半暗帶區(qū)域腦細(xì)胞核 DNA斷裂的情況，Western-blot法檢測(cè)cleaved caspase-3蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1與 Sham組相比，MCAO組小鼠腦組織切片的 TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯高于Sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

17、（P<0.05)；與MCAO組小鼠相比，RTG組小鼠腦組織切片的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯低于MCAO組小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)。
　　2各組小鼠均有 cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)；與 Sham組相比， MCAO組小鼠的cleaved caspase-3表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)；與MCAO組小鼠相比，RTG組小鼠的cleaved caspase-3表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

18、<0.05)。
　　第三部分瑞替加濱下調(diào)實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠腦組織 calpain-1、Bax，上調(diào)Bcl-2的表達(dá)
　　目的：通過(guò)測(cè)定實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠腦皮層calpain-1、Bax及Bcl-2的表達(dá)情況觀察瑞替加濱對(duì)缺血腦細(xì)胞促凋亡、抗凋亡因子的影響，探討其抑制缺血性腦細(xì)胞凋亡可能的作用機(jī)制。
　　方法：采用健康成年雄性 CD-1小鼠為研究對(duì)象，通過(guò)線栓法建立小鼠永久性大腦中動(dòng)脈閉塞模型。將 CD-1小鼠隨機(jī)分為3組：

19、假手術(shù)組（ Sham）、大腦中動(dòng)脈閉塞組（ MCAO）、瑞替加濱干預(yù)組（RTG）。假手術(shù)組小鼠接受假手術(shù)操作后1小時(shí)腹腔注射等量生理鹽水；大腦中動(dòng)脈閉塞組小鼠接受線栓法大腦中動(dòng)脈閉塞手術(shù)后1小時(shí)腹腔注射等量生理鹽水；瑞替加濱組小鼠接受線栓法大腦中動(dòng)脈閉塞手術(shù)后1小時(shí)腹腔注射瑞替加濱10mg/kg。各組小鼠于手術(shù)造模后24小時(shí)qRT-PCR檢測(cè) calpain-1、Bax、Bcl-2的 mRNA表達(dá)情況，Western-blot法及免疫組

20、織化學(xué)法檢測(cè)calpain-1、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1 qRT-PCR結(jié)果顯示：與 Sham組相比，MCAO組小鼠的 calpain-1、Bax的 mRNA表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P<0.05)；與MCAO組小鼠相比，RTG組小鼠的calpain-1、Bax的mRNA表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)；與MCAO組小鼠相比，RTG組小鼠的Bcl-2的mRNA表達(dá)明顯升高，差

21、異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)。
　　2 Western-blot結(jié)果顯示：各組小鼠均有calpain-1、Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)。與 Sham組相比，MCAO組小鼠的 calpain-1、Bax蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)；與MCAO組小鼠相比，RTG組小鼠的 calpain-1、Bax蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P<0.05)；與MCAO組小鼠相比，RTG組小鼠的Bcl-2蛋白表達(dá)明顯升高

22、，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)。
　　3免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：各組小鼠均有 calpain-1、Bax、Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞。與 Sham組相比，MCAO組小鼠的 calpain-1、Bax陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)升高；與MCAO組小鼠相比，RTG組小鼠的calpain-1、Bax陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)降低；與MCAO組小鼠相比，RTG組小鼠的Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)升高。
　　結(jié)論：
　　1本實(shí)驗(yàn)通過(guò)線栓法成功建立小鼠永久性右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞模

23、型，發(fā)現(xiàn)模型建立后1小時(shí)腹腔注射瑞替加濱5mg/kg、10mg/kg可以顯著降低小鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分及腦梗死體積，且以該劑量于局灶性腦缺血發(fā)生后0-3小時(shí)給藥均能發(fā)揮腦保護(hù)作用，為進(jìn)一步研究瑞替加濱腦保護(hù)作用的治療時(shí)間窗提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　2瑞替加濱干預(yù)可以降低實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠腦組織切片的 TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，抑制腦細(xì)胞核 DNA的斷裂；還可以降低實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠 cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)，抑制 casp