MxB抑制HIV-1的機(jī)制探討.pdf

1、病毒是一種嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生物，受本身基因組大小的限制，缺少編碼完成其自身復(fù)制所必須的生物合成以及代謝等機(jī)器，必須依賴宿主的組分進(jìn)行復(fù)制。另一方面，宿主細(xì)胞編碼了許多宿主限制因子來抑制病毒復(fù)制，從而維持自身的生存。目前對(duì)于宿主限制因子的研究中，針對(duì)HIV-1的研究較豐富，近年來已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種對(duì)其有抑制作用的宿主限制因子，包括TRIM5α、TRIM22/Staf50、SAMHD1、p21/CDKN1、Tetherin/B ST-2/CD137

2、、APOBEC3G、APOBEC3F、IFITM和MxB等。
　　其中，MxB(Myxovirus resistance protein B)是最近發(fā)現(xiàn)的能夠抑制HIV-1的宿主限制因子。但目前對(duì)于MxB抑制HIV-1的機(jī)制，研究者們尚未達(dá)成一致:一些研究者發(fā)現(xiàn)， MxB主要通過其N端區(qū)域與HIV-1的衣殼蛋白(Capsid，CA)相互作用，在病毒的脫衣殼階段發(fā)揮抗病毒功能。還有人證明，MxB是在HIV-1基因組入核或整合階段發(fā)揮

3、作用。此外，MxB抑制HIV-1可能也依賴于親環(huán)素A（Cyclophilin A，CypA）、剪接和多聚腺苷酸化特異性因子6(Cleavage andpolyadenylation specific factor6，CPSF6)、核孔蛋白Nup153和核孔蛋白Nup358等細(xì)胞蛋白的介導(dǎo)。因此，對(duì)于MxB抑制HIV-1的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。
　　MxB屬于動(dòng)力蛋白超家族成員，其氨基酸序列和同為宿主限制因子的該家族成員MxA的

4、相似度達(dá)到63％，但是MxA并不具有抑制HIV-1的活性。為了研究MxB的抗病毒機(jī)制，我們根據(jù)MxB的結(jié)構(gòu)域特征以及與MxA蛋白序列的差異，分別對(duì)MxB的N端25個(gè)氨基酸、GTPase結(jié)構(gòu)域、Loop4區(qū)域和stalk結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了序列和功能的突變。我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MxB的N端25個(gè)氨基酸以及負(fù)責(zé)其二聚化的stalk結(jié)構(gòu)域中殘基L661的突變導(dǎo)致了其抗HIV-1的功能缺失;其GTPase活性和Loop4區(qū)域?qū)τ谄淇共《竟δ軟]有影響，我們的

5、這些結(jié)果與其他課題組發(fā)表的結(jié)果一致。隨后，我們對(duì)MxB的N端25個(gè)氨基酸進(jìn)行了進(jìn)一步的分析:前人的研究表明，全長(zhǎng)形式MxB蛋白定位在胞質(zhì)及核孔的胞質(zhì)面，并且在胞質(zhì)中形成點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)，具有抑制HIV-1的功能;而缺失了前25個(gè)氨基端的截短形式的MxB蛋白在胞質(zhì)中呈彌散分布，并且不具有抑制HIV-1的功能。提示MxB蛋白的N端前25個(gè)氨基酸中存在決定其亞細(xì)胞定位及抗病毒功能的關(guān)鍵氨基酸。因而，我們對(duì)MxB N端前25個(gè)氨基酸中可能存在的核定位信

6、號(hào)進(jìn)行突變，試圖尋找影響MxB亞細(xì)胞定位以及抗病毒功能的關(guān)鍵位點(diǎn)。此外，由于MxB具有核定位信號(hào)，但是它在細(xì)胞中并不定位在細(xì)胞核中，而且當(dāng)用出核抑制劑LeptomycinB處理后，MxB蛋白在核內(nèi)積累，提示MxB可能存在出核信號(hào)，該出核信號(hào)對(duì)于其在細(xì)胞中的定位以及抗病毒功能的貢獻(xiàn)是我們研究的第二個(gè)方面。
　　首先，我們利用軟件預(yù)測(cè)了MxB的前25個(gè)氨基酸中可能存在的經(jīng)典的及非經(jīng)典的核定位信號(hào)(Nuclear localizatio

7、n signal，NLS)，并針對(duì)這些氨基酸構(gòu)建了一系列突變體，尋找對(duì)其定位及抗病毒功能有影響的位點(diǎn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，R11R12R13同時(shí)突變?yōu)锳11A12A13之后，該突變體就不具有了抗HIV-1功能，定位實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)此突變體的定位與野生型相似，這與同期Malim等人的研究結(jié)果一致，該位點(diǎn)為MxB結(jié)合HIV-1 CA的位點(diǎn)。另外，我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)MxB的R11R12R13、R19K20同時(shí)突變時(shí)，其定位發(fā)生了改變，提示這些位點(diǎn)是決定MxB在細(xì)胞

8、中定位的關(guān)鍵氨基酸，而且功能實(shí)驗(yàn)表明其抗病毒的作用消失，但由于此突變體包括R11R12R13位點(diǎn)的突變，所以不能確定MxB的定位在其抗病毒功能中的重要性。
　　另一方面，我們利用在線預(yù)測(cè)工具對(duì)MxB中可能存在的出核信號(hào)(Nuclearexport signal，NES)進(jìn)行預(yù)測(cè)，并對(duì)預(yù)測(cè)出的5段候選序列（51-68位氨基酸、98-123位氨基酸、199-223位氨基酸、374-389位氨基酸、505-527位氨基酸）進(jìn)行了缺失分析

9、。我們的結(jié)果表明，這5段序列的分別缺失并不能導(dǎo)致MxB定位在核中，提示經(jīng)由軟件預(yù)測(cè)得到的NES并不是負(fù)責(zé)MxB出核的序列，MxB另有其他的NES還是通過其他蛋白攜帶出核還有待進(jìn)一步研究。令人意外的是，我們發(fā)現(xiàn)，缺失MxB505-527位氨基酸后其抗病毒作用消失，并且在細(xì)胞中的定位發(fā)生改變。由于505-527序列位于MxB蛋白的stalk區(qū)域，而stalk區(qū)域是負(fù)責(zé)MxB蛋白二聚化的結(jié)構(gòu)域，我們檢測(cè)了MxBdel505-527形成二聚體的