高雌激素對(duì)胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞緊密連接功能的影響.pdf

1、目的:
　　IVF周期中大劑量促排卵藥物使用后多卵泡同時(shí)發(fā)育所產(chǎn)生的超生理劑量的雌激素水平被認(rèn)為和ART不良妊娠結(jié)局密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)ART來(lái)源胎盤(pán)緊密連接功能異常，由此推測(cè)IVF周期高雌激素可能通過(guò)胎盤(pán)緊密連接進(jìn)而影響滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力，引發(fā)相關(guān)妊娠合并癥。前期實(shí)驗(yàn)室已建立滋養(yǎng)細(xì)胞體外培養(yǎng)模型，通過(guò)免疫熒光開(kāi)展了滋養(yǎng)細(xì)胞緊密連接因子的表達(dá)和定位研究，并通過(guò)跨上皮電阻和細(xì)胞旁滲透性的測(cè)定實(shí)現(xiàn)了緊密連接功能的評(píng)估。本研究檢測(cè)

2、正常自然妊娠女性妊娠早期和足月分娩時(shí)外周血、絨毛組織或胎盤(pán)組織中雌二醇(E2)水平以及足月分娩時(shí)臍動(dòng)脈血E2水平;擬探討生理和超生理濃度雌激素對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞緊密連接功能及侵襲能力的影響;進(jìn)一步研究IVF超生理雌激素水平和不良妊娠結(jié)局關(guān)聯(lián)，為優(yōu)化ART條件、提高ART技術(shù)安全性提供新的依據(jù)。
　　方法:
　　(1)本研究納入20例非意愿妊娠行妊娠早期流產(chǎn)者、20例足月妊娠行剖宮產(chǎn)者，采用化學(xué)發(fā)光免疫分析(CLLA)檢測(cè)妊娠早期流產(chǎn)

3、絨毛組織、孕婦外周血以及分娩時(shí)孕婦外周血、臍動(dòng)脈血和胎盤(pán)組織中E2水平。
　　(2)利用Millicell小室系統(tǒng)培養(yǎng)BeWo細(xì)胞，建立體外滋養(yǎng)層細(xì)胞單層培養(yǎng)模型。
　　(3)利用不同濃度(0M、5×10-7M、5×10-8M、5×10-9M、5×10-10M)17β-E2作用BeWo細(xì)胞一定時(shí)間(1h、3h、6h、12h、24h)后，分別通過(guò)測(cè)定細(xì)胞跨上皮電阻(Transepithelial electrical resi

4、stance，TEER)和細(xì)胞旁滲透性的改變(Paracellular permeability，CPP)的改變，評(píng)估雌激素作用下滋養(yǎng)層緊密連接功能的改變。
　　(4)確定處理BeWo細(xì)胞12小時(shí)的選擇，該時(shí)間點(diǎn)作用BeWo細(xì)胞能最大程度反映雌激素處理細(xì)胞后改變。通過(guò)Western Blot檢測(cè)緊密連接因子ZO-1、OCLN、CLDN3、CLDN4、CLDN5、CLDN8在不同濃度17β-E2處理12h后蛋白水平表達(dá)改變。

5、　　(5)利用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)一定濃度的17β-E2處理BeWo細(xì)胞12h后緊密連接因子細(xì)胞定位的變化，研究雌激素對(duì)緊密連接功能改變的可能原因。
　　(6)體外培養(yǎng)BeWo細(xì)胞，CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度(0M、5×10-7M、5×10-8M、5×10-9M、5×10-10M)17β-E2作用BeWo細(xì)胞12h后細(xì)胞活力改變，確定該條件的選擇可以用于后續(xù)的BeWo細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)。
　　(7)利用以上實(shí)驗(yàn)條件，細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)(

6、Transwell Matrigel Invasion Assay)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力的改變。并進(jìn)一步通過(guò)Western Blot檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶2和9(MMP2、MMP9)的表達(dá)，探討高雌激素導(dǎo)致滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲能力受損的可能原因。
　　結(jié)果:
　　(1)妊娠早期的孕婦血清E2濃度[（3.44±1.30）nmol/L]低于足月妊娠孕婦[（509.78±197.82）nmol/L](t=10.2，P＜0.001);而孕早期絨毛

7、組織中E2濃度[（30.82±13.91）pmol/mg]顯著高于足月胎盤(pán)組織中E2濃度[（17.21±5.37)pmol/mg](t=4.1,P＜0.001)）。
　　(2)利用Millicell小室體外培養(yǎng)BeWo細(xì)胞，通過(guò)TEER測(cè)定和CPP分析評(píng)估不同濃度(0M、5×10-7M、5×10-8M、5×10-9M、5×10-10M)雌激素對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞作用不同時(shí)間后，對(duì)其緊密連接功能的影響。結(jié)果顯示不同濃度17β-E2處理BeW

8、o細(xì)胞1h和3h后，其TEER均無(wú)明顯變化(P＞0.05);5×10-7M、5×10-8M的17β-E2處理BeWo細(xì)胞6h后，其TEER顯著降低，CPP顯著升高（P＜0.05）;
　　(3)5×10-7M、5×10-8M、5×10-9M的17β-E2處理BeWo細(xì)胞12h和24h后，其TEER顯著降低，CPP顯著升高(P＜0.05)。其中在12h，17β-E2對(duì)BeWo的處理效應(yīng)最為明顯，且呈現(xiàn)一定的濃度依賴(lài)性。
　　(4

9、)不同濃度17β-E2作用BeWo細(xì)胞12h后Western Blot檢測(cè)各緊密連接因子蛋白水平的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)OCLN在5×10-7M、5×10-8M、5×10-9M雌激素水平表達(dá)量下調(diào)（P＜0.05）;CLDN3在5×10-7M、5×10-8M雌激素水平表達(dá)量下調(diào)(P＜0.05);其他緊密連接因子表達(dá)量無(wú)明顯改變(P＞0.05)。5×10-7M17β-E2處理BeWo細(xì)胞12h后，免疫熒光結(jié)果顯示OCLN和CLDN3表達(dá)量下調(diào)，CLDN

10、5呈現(xiàn)出從胞漿轉(zhuǎn)移至胞核的現(xiàn)象。
　　(5)體外培養(yǎng)BeWo細(xì)胞，CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度(0M、5×10-7M、5×10-8M、5×10-9M、5×10-10M)17β-E2作用BeWo細(xì)胞12h，細(xì)胞活力沒(méi)有明顯改變(P＞0.05)。
　　(6)細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)顯示僅5×10-7M、5×10-8M雌激素作用BeWo細(xì)胞12后，BeWo細(xì)胞侵襲能力下降;Western Blot結(jié)果顯示同等條件下MMP2表達(dá)下調(diào)(P＜0.

11、05)，MMP9無(wú)明顯改變(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　(1)正常自然妊娠的早期絨毛組織中含有高濃度的E2，足月分娩時(shí)胎盤(pán)組織中E2相對(duì)較低。
　　(2)本研究以BeWo細(xì)胞為模型，發(fā)現(xiàn)高水平雌激素可引起滋養(yǎng)層細(xì)胞緊密連接功能的破壞，提示ART促排產(chǎn)生的高雌激素水平可能會(huì)通過(guò)影響滋養(yǎng)層細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)進(jìn)而影響胎盤(pán)功能的正常發(fā)揮。
　　(3)高水平雌激素可以導(dǎo)致BeWo細(xì)胞侵襲功能受損，提示ART促排產(chǎn)生的