蛇毒蛋白Triflin PR-1結(jié)構(gòu)域TFPR1的免疫增強作用及作用機制研究.pdf

1、疫苗接種是防治傳染性疾病的有效途徑。近年來，更安全、有效的新型疫苗的研發(fā)日益受到重視。新型疫苗包括亞單位疫苗、合成肽疫苗、基因工程疫苗等，其分子小、免疫原性相對較差，難以產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答，需要佐劑來增強其免疫原性或宿主對抗原的保護性應(yīng)答。目前美國FDA批準(zhǔn)的廣泛用于人群疫苗的鋁鹽佐劑誘導(dǎo)的細胞免疫較弱，對于某些新型疫苗佐劑活性較差，尤其是對于分子量小的多肽抗原無佐劑活性，不能完全滿足新型疫苗發(fā)展的需要。發(fā)現(xiàn)和研發(fā)更安全有效的新型免疫調(diào)

2、節(jié)劑對疫苗的發(fā)展具有十分重要的意義。
　　Triflin是一種蛇毒CRISPs蛋白，其N端PR-1結(jié)構(gòu)域與植物中具有抵抗病原感染的PR-1蛋白在空間結(jié)構(gòu)上具有高度同源性，推測可能與免疫調(diào)節(jié)作用相關(guān)。本研究針對Triflin的PR-1結(jié)構(gòu)域，系統(tǒng)進行了PR-1結(jié)構(gòu)域的重組表達、免疫增效作用及作用機制研究。
　　研究目的：
　　本研究探索Triflin蛋白PR-1結(jié)構(gòu)域為基礎(chǔ)的重組蛋白TFPR1的佐劑活性及其免疫調(diào)節(jié)機制，

3、不但可闡明PR-1結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)功能，同時可獲得一種新型佐劑，為新型疫苗的研究奠定基礎(chǔ)，也為新型佐劑的發(fā)現(xiàn)、設(shè)計及研發(fā)提供新思路。
　　研究方法：
　　(1) Triflin蛋白結(jié)構(gòu)分析及重組蛋白TFPR1的制備。
　　通過對Triflin蛋白序列N端進行二級結(jié)構(gòu)分析和同源建模預(yù)測，確定以該蛋白PR-1結(jié)構(gòu)域為基礎(chǔ)的重組蛋白TFPR1的對應(yīng)基因序列;根據(jù)大腸桿菌密碼子嗜性優(yōu)化后進行人工合成并采用原核系統(tǒng)進行表達，誘導(dǎo)表

4、達的目的蛋白TFPR1經(jīng)SDS-PAGE和Western blot鑒定，并分析其表達形式;利用鎳柱親和層析法純化包涵體蛋白，采用透析法進行蛋白復(fù)性;分別利用SDS-PAGE檢測蛋白純度、Bradford法測定蛋白濃度以及鱟試劑凝膠法測定蛋白內(nèi)毒素含量;分析重組蛋白TFPR1的穩(wěn)定性，并以復(fù)性后TFPR1免疫BALB/c雌性小鼠，分析其在小鼠體內(nèi)的生物活性。
　　(2)重組蛋白TFPR1對蛋白和多肽抗原的免疫增強作用研究。
　

5、　分別以經(jīng)典模式抗原OVA、重組蛋白類抗原HBsAg及小分子肽類抗原HIV-1 Pep5作為模式抗原，依照一定比例簡單混合后肌肉注射途徑免疫BALB/c雌性小鼠，以人用鋁鹽佐劑為對照，ELISA法和ELISPOT法分別檢測小鼠對抗原的體液免疫和細胞免疫應(yīng)答情況，分析重組蛋白TFPR1的免疫增效特點;在TFPR1自身抗體存在的情況下，分析預(yù)存抗體對TFPR1佐劑活性的影響。
　　(3)重組蛋白TFPR1增強抗原免疫應(yīng)答的作用機制研究

6、。
　　以人PBMCs為對象，開展重組蛋白TFPR1體外結(jié)合及刺激實驗。利用流式細胞技術(shù)分析TFPR1結(jié)合的免疫細胞類別;利用ELISA法檢測細胞樣本在蛋白刺激后產(chǎn)生的不同細胞因子水平;進一步利用toll樣受體的抗體封閉實驗、NF-κB通路阻斷實驗探索TFPR1蛋白參與免疫調(diào)節(jié)的具體通路及機制。
　　研究結(jié)果：
　　(1)成功設(shè)計并表達了具有生物活性的重組蛋白TFPR1。
　　重組蛋白TFPR1為Triflin蛋

7、白的生物信息學(xué)分析設(shè)計，具有PR-1結(jié)構(gòu)域的經(jīng)典結(jié)構(gòu)，即α-β-α的三明治結(jié)構(gòu);TFPR1在大腸桿菌中主要以包涵體形式表達，經(jīng)純化復(fù)性后獲得純度95％以上的重組蛋白，復(fù)性后的TFPR1主要以單體形式存在，其次為二聚體;在未添加任何穩(wěn)定劑和防腐劑的條件下，重組蛋白TFPR1在磷酸鹽緩沖液中常溫保存三個月仍有75％的蛋白保持穩(wěn)定，說明該蛋白具有良好的穩(wěn)定性;經(jīng)內(nèi)毒素去除，重組蛋白TFPR1的內(nèi)毒素含量低于0.25EU;重組蛋白TFPR1肌肉

8、途徑免疫小鼠無需任何佐劑即可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生較高的抗TFPR1的抗體，表明TFPR1具有自身佐劑活性。
　　(2)重組蛋白TFPR1可顯著增強蛋白類和多肽類抗原的免疫原性，同時誘導(dǎo)體液和細胞免疫。
　　以不同模式抗原探究重組蛋白TFPR1的佐劑活性，研究表明TFPR1具有佐劑活性，與蛋白、多肽類抗原簡單混合后，可引起較強的體液和細胞免疫應(yīng)答，具有Th1型偏倚的免疫應(yīng)答，佐劑活性優(yōu)于鋁鹽佐劑;重組蛋白TFPR1具有良好的安全性，不

9、會引起免疫小鼠的不良反應(yīng);同時，在抗TFPR1抗體存在的條件下并不影響其佐劑活性。
　　(3)重組蛋白TFPR1可能通過結(jié)合TLR4繼而激活免疫細胞產(chǎn)生Th1型和調(diào)節(jié)型細胞因子.
　　采用現(xiàn)代分子生物學(xué)及免疫學(xué)實驗，從細胞和分子水平對TFPR1的免疫增效機制進行研究。實驗表明，重組蛋白TFPR1可結(jié)合不同類型的免疫細胞，刺激人PBMCs產(chǎn)生INF-γ、TNF-α、IL-6及IL-10等不同類型的細胞因子;這種激活作用是劑量依

10、賴的。繼而發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用具有中和作用的抗人TLR4多克隆抗體封閉PBMCs后，再加入TFPR1刺激，其上清中的IFN-γ顯著下降;最后，以TFPR1蛋白刺激穩(wěn)定表達TLR4的293T細胞系，其IL-8顯著升高，而陰性對照組則無IL-8產(chǎn)生，這進一步證明TFPR1免疫調(diào)節(jié)作用可能通過激活TLR4發(fā)揮作用。
　　研究結(jié)論：
　　本研究構(gòu)建并成功表達triflin蛋白的活性功能區(qū)TFPR1，并發(fā)現(xiàn)TFPR1蛋白具有良好的免疫增效作用。

11、TFPR1只需與抗原簡單混合，無需偶聯(lián)，不但可以增強蛋白抗原（卵白蛋白和重組乙肝表面抗原）的免疫原性，誘導(dǎo)Th1偏倚的Th1/Th2體液免疫應(yīng)答和細胞免疫應(yīng)答;更為重要的是，TFPR1可以顯著增強多肽抗原的免疫原性。重組蛋白TFPR1可能通過TLR4進而激活免疫細胞產(chǎn)生Th1型和調(diào)節(jié)性細胞因子發(fā)揮免疫增強作用。
　　本研究發(fā)現(xiàn)了一種具有良好免疫增效作用的免疫調(diào)節(jié)分子。這不但對疫苗研發(fā)具有重要意義，同時也揭示了PR-1結(jié)構(gòu)域的免疫調(diào)