賴氨酸特異性去甲基化酶1在卵巢癌細(xì)胞增殖和凋亡中作用的研究.pdf

1、背景和目的：賴氨酸特異性去甲基化酶1（lysine-specific demethylase1， LSD1）是2004年發(fā)現(xiàn)的一種黃素腺嘌呤二核苷酸（Flavin adenine dinulcleotide, FAD）依賴性胺氧化酶，它能通過氧化反應(yīng)生成甲醛而特異性去除組蛋白H3第4位賴氨酸（H3K4）和第9位賴氨酸（H3K9）的甲基化修飾，調(diào)控著基因轉(zhuǎn)錄的激活與抑制，發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。最近的研究顯示LSD1在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、增殖

2、及遷移侵襲中扮演重要的角色。目前已有研究報(bào)道LSD1在卵巢癌組織和細(xì)胞株中高度表達(dá)，而與卵巢癌細(xì)胞增殖關(guān)系尚不明確。因此，本研究以卵巢癌細(xì)胞HO8910為研究對(duì)象，探索LSD1基因過表達(dá)、敲低及其酶活性抑制對(duì)HO8910細(xì)胞增殖、周期和凋亡的影響，以及對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。
　　方法：1.利用慢病毒載體構(gòu)建穩(wěn)定干擾LSD1的卵巢癌HO8910細(xì)胞株，首先合成特異性針對(duì)LSD1基因的shRNA，插入pLKO-Tet

3、-On載體，構(gòu)建重組慢病毒質(zhì)粒 pLKO-Tet-On-shLSD1；然后將 pLKO-Tet-On-shLSD1、pHR’-CMV-8.2ΔVPR和 pHR’-CMV-VSVG三種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染試劑采用Lipofectamine2000包裝產(chǎn)生慢病毒；再將攜帶有LSD1-shRNA的慢病毒感染HO8910細(xì)胞，采用嘌呤霉素篩選LSD1-shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)入的HO8910細(xì)胞。
　　2.構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá) LSD1的卵巢癌

4、細(xì)胞株，首先用 Lipofectamine2000將pLVX-Tet-On、pHR’-CMV-8.2ΔVPR及pHR’-CMV-VSVG三種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收集病毒上清感染 HO8910細(xì)胞，采用 G418篩選細(xì)胞得到穩(wěn)定的HO8910-rtTA細(xì)胞；再用包含 pLVX-tight-puro-LSD1的慢病毒顆粒感染HO8910-rtTA細(xì)胞，用嘌呤霉素篩選細(xì)胞得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染過表達(dá)LSD1細(xì)胞株。
　　3.用實(shí)時(shí)定量 RT-

5、PCR和 Western blot法分別檢測(cè) LSD1干擾（LSD1-knockdown, LSD1-KD）和過表達(dá)（LSD1-overexpression, LSD1-OE）的HO8910細(xì)胞中LSD1 mRNA和蛋白的表達(dá)及其底物H3K4me2表達(dá)水平。
　　4.利用不同濃度（0、25、50、100μmol/L）LSD1特異性抑制劑tranylcypromine(TCP)處理HO8910細(xì)胞，采用MTT法和EdU DNA標(biāo)記法

6、檢測(cè)細(xì)胞的增殖；在LSD1-KD和LSD1-OE HO8910細(xì)胞中，加入不同濃度（0、1、10、100 ng/mL） doxycycline(Dox)誘導(dǎo)LSD1敲低或過表達(dá)后，檢測(cè)細(xì)胞增殖的變化。
　　5.采用Annexin V/PI和流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)上述不同處理組中細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的變化。
　　6.利用Western blot法檢測(cè)不同處理組細(xì)胞中P21、Bax、Bcl-2和Survivin蛋白的表達(dá)水平。

7、　　結(jié)果：成功建立了穩(wěn)定干擾LSD1和過表達(dá)LSD1的卵巢癌HO8910細(xì)胞株；干擾LSD1基因表達(dá)或抑制LSD1酶活性，能夠顯著抑制HO8910細(xì)胞的增殖和促進(jìn)細(xì)胞的凋亡（P﹤0.05）；而 LSD1過量表達(dá)，則顯著促進(jìn) HO8910細(xì)胞的增殖及抑制細(xì)胞的凋亡。此外，LSD1表達(dá)下調(diào)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯在G1期，并下調(diào)促存活蛋白Bcl-2和Survivin的表達(dá)，以及上調(diào)促凋亡蛋白P21和Bax表達(dá)；相反，外源性表達(dá)LSD1能夠促進(jìn)HO8