類(lèi)A因子級(jí)聯(lián)系統(tǒng)對(duì)井岡霉素合成的調(diào)控.pdf

1、放線菌是一類(lèi)高 GC含量的革蘭氏陽(yáng)性菌,目前已知抗生素中有60％以上是由放線菌合成。鏈霉菌是一類(lèi)高等放線菌,具有強(qiáng)大的抗生素合成能力和復(fù)雜的形態(tài)分化,故一直受到人們的關(guān)注。自上世紀(jì)六十年代,有關(guān)以A因子為代表的g-丁內(nèi)酯類(lèi)自誘導(dǎo)信號(hào)分子在鏈霉菌次級(jí)代謝與分化中的作用及其機(jī)制,已有大量報(bào)道。但是,在不同鏈霉菌中其調(diào)控作用和方式也不盡相同,尚存在不少需要深入研究的科學(xué)問(wèn)題。深入研究g-丁內(nèi)酯調(diào)控系統(tǒng)對(duì)鏈霉菌工業(yè)菌株的次級(jí)代謝的調(diào)控作用及其機(jī)

2、制,將為如何利用代謝調(diào)控和代謝工程來(lái)提高抗生素的工業(yè)發(fā)酵水平提供重要的理論指導(dǎo)。
　　井岡霉素,又稱(chēng)有效霉素,是一種由吸水鏈霉菌井岡亞種5008(簡(jiǎn)稱(chēng)5008)產(chǎn)生的C7N氨基環(huán)醇類(lèi)抗生素。由于井岡霉素能抑制真菌生長(zhǎng),可高效防治水稻紋枯病,故被廣泛用于我國(guó)和亞洲其他水稻產(chǎn)區(qū)。此外,井岡霉素及有效氧胺等其他井岡霉素生物合成的中間產(chǎn)物都可用于生產(chǎn)治療II型糖尿病的藥物。鑒于井岡霉素的重要性,本微生物代謝國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鄧子新院士團(tuán)隊(duì)在2

3、005年鑒定完成了井岡霉素生物合成基因簇,2012年完成了5008的全基因組測(cè)序。本論文通過(guò)對(duì)基因組進(jìn)行分析,在其染色體上找到了A因子調(diào)控相關(guān)的同源基因,這暗示5008中可能存在類(lèi)A因子級(jí)聯(lián)系統(tǒng);有關(guān)類(lèi)A因子級(jí)聯(lián)系統(tǒng)對(duì)井岡霉素生物合成的調(diào)控則尚待研究。
　　本文首先利用天藍(lán)色鏈霉菌M145作為指示菌檢測(cè)到了5008發(fā)酵液中的g-丁內(nèi)酯信號(hào)分子。隨后,將一種廉價(jià)的A因子結(jié)構(gòu)類(lèi)似物1,4-丁內(nèi)酯(1,4-BL)應(yīng)用于井岡霉素發(fā)酵,來(lái)考

4、察其是否產(chǎn)生影響。5008菌株的搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在發(fā)酵12小時(shí)添加10mM的1,4-BL可提高井岡霉素的產(chǎn)量達(dá)30%左右;轉(zhuǎn)錄分析結(jié)果表明,添加1,4-BL能提高adpA-H等A因子級(jí)聯(lián)調(diào)控相關(guān)同源基因和井岡霉素合成基因簇的轉(zhuǎn)錄水平。在5008菌株的發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)中,添加1,4-BL也使井岡霉素產(chǎn)量提高約30%;同樣,在工業(yè)菌株TL01(5008的高產(chǎn)誘變菌株)的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中,添加1,4-BL也顯著促進(jìn)了井岡霉素的合成。這些結(jié)果說(shuō)明,添

5、加1,4-BL是一種簡(jiǎn)單而且有效提高井岡霉素發(fā)酵水平的策略。據(jù)此,我們推測(cè)1,4-BL能影響5008中的類(lèi)A因子級(jí)聯(lián)系統(tǒng),通過(guò)提高井岡霉素合成基因簇的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)而提高抗生素的產(chǎn)量。
　　隨后,本研究進(jìn)一步考察了1,4-BL促進(jìn)井岡霉素生物合成的作用機(jī)理以及類(lèi)A因子級(jí)聯(lián)系統(tǒng)對(duì)井岡霉素的調(diào)控作用。通過(guò)全基因組的分析,找到了三個(gè)可能的ArpA同源蛋白ShbR1、ShbR2和ShbR3。體內(nèi)基因缺失和體外圓二色譜分析的結(jié)果表明1,4-BL

6、主要通過(guò)ShbR3發(fā)揮作用。凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(EMSA)和轉(zhuǎn)錄分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,ShbR3可通過(guò)直接結(jié)合adpA-H的啟動(dòng)子來(lái)抑制其轉(zhuǎn)錄,而1,4-BL對(duì)ShbR3與adpA-H啟動(dòng)子的結(jié)合有一定的解除作用。通過(guò)缺失adpA-H基因,valABC的轉(zhuǎn)錄被完全抑制,valKLMN和valG的轉(zhuǎn)錄也被不同程度地被抑制了;并且HPLC和LC-MS的分析結(jié)果確認(rèn)突變株喪失了合成井岡霉素的能力。另外,通過(guò)EMSA實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn) AdpA-H可特異性地結(jié)合

7、在valKLMN與valABC啟動(dòng)子間區(qū)。以上結(jié)果表明, AdpA-H可結(jié)合在井岡霉素基因簇上,進(jìn)而控制valABC以及其他操縱子的轉(zhuǎn)錄從而直接調(diào)控井岡霉素的生物合成。上述研究一方面揭示了1,4-BL能誘導(dǎo)抗生素(井岡霉素)合成的作用機(jī)制,同時(shí)也揭示了類(lèi)A因子系統(tǒng)在其中所起的作用。
　　在研究的同時(shí),我們也注意到鏈霉菌染色體中多套afsA-arpA同源基因共存的現(xiàn)象。由于目前已有的研究都集中在單套afsA-arpA同源基因的調(diào)控機(jī)

8、制上,故本研究探索了多套類(lèi)A因子系統(tǒng)級(jí)聯(lián)調(diào)控的作用機(jī)制。我們首先考察了5008中三套afsA-arpA同源基因在發(fā)酵過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄,觀察到這三套 afsA-arpA均為非沉默基因并且轉(zhuǎn)錄存在一定的時(shí)序性?；蛉笔У膶?shí)驗(yàn)結(jié)果表明:afsA的三個(gè)同源基因的失活會(huì)顯著抑制井岡霉素發(fā)酵產(chǎn)量,抑制的幅度高達(dá)60~90%;失活arpA的三個(gè)同源基因shbR1,shbR2和shbR3之后,井岡霉素的發(fā)酵產(chǎn)量分別提高了29%,7.8%和15%。通過(guò)基因缺

9、失及EMSA分析發(fā)現(xiàn)ShbR1能直接結(jié)合在adpA-H啟動(dòng)子上,缺失shbR1僅提高adpA-H在發(fā)酵24小時(shí)的轉(zhuǎn)錄水平,雙缺失shbR1/R3使adpA-H的轉(zhuǎn)錄水平在發(fā)酵12小時(shí)也顯著提高了,這表明ShbR1與ShbR3對(duì)adpA-H的轉(zhuǎn)錄調(diào)控具有時(shí)序性。進(jìn)一步考察ShbR1與ShbR3的調(diào)控關(guān)系發(fā)現(xiàn),ShbR1能直接結(jié)合在shbR3的啟動(dòng)子上,正調(diào)控shbR3的基因轉(zhuǎn)錄。在揭示上述調(diào)控機(jī)制之后,我們嘗試通過(guò)雙缺失 shbR1/R3

10、來(lái)提高井岡霉素的發(fā)酵水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因雙缺失能顯著上調(diào) valABC的轉(zhuǎn)錄水平,提高井岡霉素的產(chǎn)量達(dá)50%以上。針對(duì)工業(yè)高產(chǎn)菌株TL01,通過(guò)缺失shbR1/R3之后,最終井岡霉素發(fā)酵產(chǎn)量由19g/L提高到23g/L,同時(shí)發(fā)酵速度也加快,發(fā)酵周期縮短48小時(shí)。以上結(jié)果表明,解除shbR1與shbR3對(duì)adpA-H的負(fù)調(diào)控是一種有效的代謝調(diào)控改造的策略,可顯著提高工業(yè)菌株的發(fā)酵水平。
　　綜上所述,添加A因子結(jié)構(gòu)類(lèi)似物1,4-BL是

11、一種簡(jiǎn)單而有效的發(fā)酵策略,可顯著提高井岡霉素的發(fā)酵產(chǎn)量,并有望應(yīng)用于大規(guī)模工業(yè)化發(fā)酵;全局調(diào)控蛋白AdpA-H通過(guò)與井岡霉素基因簇中啟動(dòng)子區(qū)域相結(jié)合直接控制結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄從而實(shí)現(xiàn)對(duì)井岡霉素生物合成的調(diào)控;ShbR3可直接結(jié)合在adpA-H的啟動(dòng)子上負(fù)調(diào)控adpA-H的轉(zhuǎn)錄,1,4-BL可與ShbR3相互作用使得adpA-H的轉(zhuǎn)錄上調(diào),進(jìn)而促進(jìn)抗生素的合成;在5008的多套afsA-arpA同源基因系統(tǒng)中,ShbR1與ShbR3能時(shí)序性地