mTOR-Cdc42信號通路在慢性阻塞性肺疾病小鼠肺泡巨噬細(xì)胞吞噬功能低下中的作用及機(jī)制.pdf

1、目的:探討哺乳動物雷帕霉素靶蛋白-細(xì)胞分裂周期蛋白42（mTOR-Cdc42）信號通路在慢性阻塞性肺疾?。璺危┬∈蠓闻菥奘杉?xì)胞（AM）吞噬功能低下中的作用。
　　方法：將40只SPF級8周齡雄性 BALB/c小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為健康對照組、慢阻肺組、健康雷帕霉素組及慢阻肺雷帕霉素組，每組10只。采用90天單純香煙煙霧暴露法建立慢阻肺小鼠模型，造模結(jié)束后觀察各組小鼠的肺功能及病理變化，分離小鼠 AM，其中健康雷帕霉素組及慢阻肺

2、雷帕霉素組用終濃度10nmol/L雷帕霉素孵育24h。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠AM吞噬異硫氰酸酯熒光素標(biāo)記大腸桿菌（FITC-E.coli）的能力；采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法檢測AM mTOR及Cdc42 mRNA的表達(dá)；采用蛋白印跡（Western Blot）法檢測AM mTOR、磷酸化-mTOR（p-mTOR）以及Cdc42蛋白的表達(dá)；采用小G蛋白活性（G-LISA）試劑盒檢測AM Cdc42的活性；采用激光共聚焦

3、顯微鏡觀察AM細(xì)胞骨架變化。
　　結(jié)果：（1）慢阻肺小鼠模型的肺功能及肺組織病理改變：吸氣峰流速（PIF）、呼氣峰流速（PEF)和呼出50％潮氣量時的流速（EF50）：慢阻肺組(7.5±1.0、4.67±0.6、3.29±0.43）明顯低于健康對照組（11.61±1.12、7.63±0.44、5.05±0.37）（均P＜0.01)；慢阻肺小鼠肺組織光鏡下可見明顯的支氣管炎癥和肺氣腫改變，健康對照組小鼠無上述改變。
　?。?）

4、AM吞噬 FITC-E.coli的能力：用平均熒光強(qiáng)度（MFI）和吞噬陽性細(xì)胞百分比（吞噬％）表示：慢阻肺組（4060±590、28.65±1.26）較健康對照組（9190±988、67.50±4.56）明顯降低(均P<0.01)；慢阻肺雷帕霉素組（4856±762、38.31±1.71）比慢阻肺組增高(P＜0.05或P＜0.01)；健康雷帕霉素組（9207±967、67.91±3.64）較健康對照組無差異。
　?。?）AM mT

5、OR、Cdc42 mRNA的表達(dá)：慢阻肺組AM mTOR、Cdc42 mRNA的表達(dá)（2.62±0.46、2.56±0.50）較健康對照組（1.00±0.00、1.00±0.00）明顯增加（均P＜0.01）；慢阻肺雷帕霉素組AM mTOR、Cdc42 mRNA的表達(dá)（1.40±0.36、1.38±0.34）較慢阻肺組明顯降低（均 P＜0.01）；健康雷帕霉素組 AM mTOR、Cdc42 mRNA的表達(dá)（0.94±0.37、0.90±0

6、.34）較健康對照組無差異。
　　（4）AM mTOR、p-mTOR以及Cdc42蛋白表達(dá)：慢阻肺組（1.3047±0.5188、1.4645±0.4330、1.6121±0.3749）較健康對照組（0.4829±0.2674、0.5798±0.2552、0.6671±0.2168）明顯增加（均P＜0.01）；慢阻肺雷帕霉素組（0.8996±0.6634、0.9208±0.2771、0.9143±0.4764）較慢阻肺組降低（P＜

7、0.05或P＜0.01）；健康雷帕霉素組（0.4725±0.2845、0.5592±0.2176、0.6368±0.22）較健康對照組無差異。
　?。?） AM Cdc42的活性：慢阻肺組（0.4591±0.0853）較健康對照組（0.2995±0.0674）明顯升高（P＜0.01）；慢阻肺雷帕霉素組（0.3616±0.060）較慢阻肺組降低（P＜0.01）；而健康雷帕霉素組（0.2668±0.0572）較健康對照組無差異。

8、>　?。?）AM細(xì)胞骨架變化：慢阻肺組AM細(xì)胞周圍可見絲狀偽足伸出雜亂、長短不一，板狀偽足面積增加；慢阻肺雷帕霉素組AM細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，呈圓形或橢圓形，周圍可見較長的絲狀偽足；健康對照組和健康雷帕霉素組AM細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，呈圓形或者橢圓形，細(xì)胞周圍未見明顯的絲狀偽足。
　?。?）相關(guān)性分析：各組小鼠 AM mTOR和Cdc42的mRNA、蛋白，p-mTOR蛋白以及Cdc42的活性與AM吞噬FITC-E.coli的平均熒光強(qiáng)度均呈負(fù)相關(guān)

9、（P＜0.05或P＜0.01）；各組小鼠AM mTOR的mRNA、蛋白及p-mTOR蛋白與Cdc42的mRNA、蛋白和活性均呈正相關(guān)（P＜0.05或者P＜0.01）。
　　結(jié)論：單純香煙煙霧可復(fù)制慢阻肺小鼠模型；慢阻肺小鼠AM吞噬功能降低；mTOR-Cdc42信號通路在慢阻肺小鼠 AM中處于活化狀態(tài)；mTOR-Cdc42信號通路活化致慢阻肺小鼠AM細(xì)胞骨架異常重排與其吞噬功能低下有關(guān)；雷帕霉素抑制慢阻肺mTOR-Cdc42信號通路