產(chǎn)PUFAs轉(zhuǎn)基因株的構(gòu)建.pdf

1、多不飽和脂肪酸（PUFAs），尤其是長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸，具有重要的生理與保健功能。目前，ω6系列的多不飽和脂肪酸主要來(lái)源是微生物發(fā)酵，ω3系列多不飽和脂肪酸主要來(lái)源于魚油，魚油來(lái)源有限，脂肪酸提取工藝復(fù)雜且難以保證純度。
　　 Ω6系列與ω3系列多不飽和脂肪酸目前都存在價(jià)格昂貴、不能滿足市場(chǎng)需求的缺點(diǎn)。
　　 利用基因工程手段提高微生物中長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的產(chǎn)量以及在油料作物中生產(chǎn)長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸，是兩種有效的方法。本

2、研究使用三角褐指藻的Δ6 脫飽和酶基因、Δ6 延長(zhǎng)酶基因與Δ5 脫飽和酶基因，利用可以體外構(gòu)建多拷貝表達(dá)盒的酵母表達(dá)載體pAO815，構(gòu)建了含有Δ6 脫飽和酶基因、Δ6 延長(zhǎng)酶基因與Δ5 脫飽和酶基因的多價(jià)表達(dá)載體（pAO1×D6E6D5），并構(gòu)建了三個(gè)基因各有兩個(gè)拷貝的表達(dá)載體（pAO2×D6E6D5），分別轉(zhuǎn)化畢赤酵母，構(gòu)建成產(chǎn)長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的基因工程菌（PpDED和Pp2D2E2D）；使用來(lái)自甘藍(lán)型油菜的種子特異表達(dá)啟動(dòng)子-n

3、apin 啟動(dòng)子，將三角褐指藻的Δ6 脫飽和酶基因、Δ6 延長(zhǎng)酶基因與Δ5 脫飽和酶基因構(gòu)建入植物表達(dá)載體pCAMBIA1303，每個(gè)基因都處于napin 啟動(dòng)子的控制下，構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化擬南芥和甘藍(lán)型油菜，得到了產(chǎn)長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)基因擬南芥，并初步得到轉(zhuǎn)基因的甘藍(lán)型油菜苗。具體結(jié)果如下：
　　 1.轉(zhuǎn)基因酵母的Southern 雜交結(jié)果顯示，Δ6 脫飽和酶基因、Δ6 延長(zhǎng)酶基因與Δ5脫飽和酶基因已經(jīng)整合入酵母的基因組，用p

4、AO1×D6E6D5轉(zhuǎn)化的酵母其基因組中整合有單拷貝的D6E6D5，而用pAO2×D6E6D55轉(zhuǎn)化的酵母其基因組中整合有雙拷貝的D6E6D5。
　　 2.對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)的PpDED和Pp2D2E2D 進(jìn)行半定量RT-PCR 分析，結(jié)果表明Δ6脫飽和酶、Δ5 脫飽和酶和Δ6 延長(zhǎng)酶基因在Pp2D2E2D中的表達(dá)量分別是在PpDED中的1.87、1.92、1.74 倍，表明增加基因的拷貝數(shù)，可以顯著提高mRNA的表達(dá)量。
　　

5、 3. GC-MS 分析誘導(dǎo)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因酵母的脂肪酸，在PpDED中，GLA、DGLA、AA 占總脂肪酸的含量分別為3.5%，1.4%，0.1%；SDA、ETA和EPA 占總脂肪酸的含量分別為0.6%，0.1%，0.05%。在Pp2D2E2D中，GLA、DGLA、AA 占總脂肪酸的含量分別為4.2%，2.4%，0.3%；SDA、ETA和EPA 占總脂肪酸的含量分別為0.6%，0.2%，0.1%。Pp2D2E2D中AA和EPA 占總脂肪酸

6、的含量分別是PpDED中的三倍和兩倍。
　　 4.分析轉(zhuǎn)入的基因在重組酵母的轉(zhuǎn)化效率，Δ6 脫飽和酶的轉(zhuǎn)化效率在PpDED中分別為22.7%（ω6）和20.7%（ω3），而在Pp2D2E2D中則增加為33.9%（ω6）和33.3%（ω3）。Δ6 延長(zhǎng)酶的轉(zhuǎn)化效率在PpDED中分別為28.6%（ω6）和14.3%（ω3），在Pp2D2E2D中則增加為36.4%（ω6）和25%（ω3）。Δ5 脫飽和酶的轉(zhuǎn)化效率在ω3步驟中沒(méi)有變化，

7、均為33.3%，在ω6 步驟中，轉(zhuǎn)化效率則從6.7%提高到11.1%。
　　 5.得到了能夠產(chǎn)長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的轉(zhuǎn)基因擬南芥，Southern 雜交結(jié)果顯示Δ6脫飽和酶、Δ5 脫飽和酶和Δ6 延長(zhǎng)酶基因已整合入擬南芥基因組。轉(zhuǎn)入的外源基因都只在種子中表達(dá)。轉(zhuǎn)基因擬南芥種子中GLA，DGLA，AA的含量分別為6.2％、1.6％、0.5％，SDA，ETA，EPA的含量分別為0.9％、0.5％、0.05％。
　　 6.通過(guò)潮