活血祛瘀法防治激素性股骨頭壞死塌陷的實(shí)驗(yàn)與臨床研究.pdf

1、目的:
　　1.觀察兔激素性股骨頭壞死(steroid-induced osteonecrosis of femoralhead，SIONFH)模型自然修復(fù)過程中骨小梁空間結(jié)構(gòu)參數(shù)的變化以及改建方式。
　　2.觀察活血祛瘀法對(duì)兔激素性股骨頭壞死修復(fù)的影響。
　　3.評(píng)價(jià)體外Micro-CT和體內(nèi)高分辨率磁共振(HRMRI)檢測(cè)動(dòng)物模型骨小梁空間結(jié)構(gòu)改變的一致性。
　　4.觀察藥物作用下模型壞死骨周圍組織細(xì)胞因子的

2、變化，分析活血祛瘀法對(duì)成骨-破骨偶聯(lián)的調(diào)控。
　　5.評(píng)價(jià)臨床上活血祛瘀法治療SIONFH療效，觀察骨小梁空間結(jié)構(gòu)參數(shù)變化及骨小梁改建方式，剖析“活血祛瘀法”防治激素性股骨頭壞死塌陷的作用機(jī)理。
　　方法:
　　1.第一部分，評(píng)價(jià)活血祛瘀法對(duì)兔激素性股骨頭壞死修復(fù)的影響:50只健康的成年新西蘭大白兔，將其隨機(jī)分入模型組、中藥組和空白組，其中模型組和中藥組各20只，空白組10只。內(nèi)毒素(LPS)聯(lián)合甲強(qiáng)龍(MPS)按照L

3、PS×1(10μg/kg)耳緣靜脈注射結(jié)合MPS×6(40mg/kg)肌肉注射制作兔激素性股骨頭壞死模型。中藥組使用《醫(yī)宗金鑒》方桃紅四物湯按照兔與人等效劑量灌胃處理。分別于第2、4、8、12周行HE染色和HRMRI、Micro-CT檢測(cè)，觀察壞死及修復(fù)情況。HRMRI最小空間分辨率≤0.03mm，Micro-CT最小空間分辨率≤0.035mm，設(shè)定骨小梁成像結(jié)構(gòu)參數(shù)，比較HRMRI和Micro-CT在測(cè)量股骨頭壞死骨小梁改建過程中的作

4、用。在上述相同時(shí)間點(diǎn)，利用Western Blot技術(shù)檢測(cè)兔股骨頭RANK、RANKL、VEGF、OPG、RUNX2、OPN、ABCB1、PPARγ蛋白表達(dá)水平。
　　2.第二部分，討論活血祛瘀法防治人股骨頭壞死塌陷的作用機(jī)理:參照《成人股骨頭壞死診療標(biāo)準(zhǔn)專家共識(shí)(2012年版)》及《股骨頭壞死診斷與治療的專家建議》的診斷標(biāo)準(zhǔn)，篩選自2011年12月～2014年10月，于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨關(guān)節(jié)科就診并符合納入標(biāo)準(zhǔn)的SIO

5、NFH病例共36例64髖。其中雙側(cè)發(fā)病28例，男性20例，女性16例。年齡20～50歲，平均35歲?；颊呔驮\時(shí)出現(xiàn)關(guān)節(jié)疼痛的時(shí)間為2～24周，平均17周。簽署知情同意書，經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后入組。每3個(gè)月行雙髖正、蛙位X線檢查，分別測(cè)量記錄股骨頭發(fā)生塌陷時(shí)間和塌陷高度。每6個(gè)月行HRMRI平掃，測(cè)量骨小梁相關(guān)空間結(jié)構(gòu)參數(shù)。在治療前、服藥3個(gè)月、服藥6個(gè)月、服藥1年、服藥2年，分別記錄患者Harris評(píng)分。隨訪時(shí)間14～38個(gè)月，平

6、均為27個(gè)月?；诨颊叩腍RMRI影像資料，利用Mimics13.1醫(yī)學(xué)影像控制系統(tǒng)重建壞死區(qū)、硬化區(qū)的三維結(jié)構(gòu);利用圖像處理軟件ImageJ評(píng)價(jià)承重區(qū)冠狀面壞死面積和硬化區(qū)面積在股骨頭縱切面中的比值。通過表觀骨小梁空間結(jié)構(gòu)改變，分析活血祛瘀法防治股骨頭壞死塌陷的作用機(jī)理。
　　結(jié)果:
　　1.SIONFH造模評(píng)估:40只新西蘭大白兔，中藥組(n=20)與模型組(n=20)同時(shí)注射內(nèi)毒素后，48h內(nèi)共死亡7只，33只存活，存

7、活率82.5％。模型組共14只出現(xiàn)壞死征象，壞死發(fā)生率為82.4％(14/17);中藥組5只出現(xiàn)壞死征象，壞死發(fā)生率為31.3％(5/16)。
　　2.組織學(xué)觀察:兔股骨頭切片HE染色顯示:模型組:軟骨面皺褶，骨小梁顯著較正常組稀疏，局部骨小梁斷裂，骨細(xì)胞核固縮，大量空骨陷窩形成，骨髓脂肪細(xì)胞堆積;正常組:骨小梁結(jié)構(gòu)完整，空間排布規(guī)則，小梁內(nèi)的骨細(xì)胞清晰可見，空骨陷窩的數(shù)量較少，骨髓中存在豐富的造血細(xì)胞，脂肪細(xì)胞含量相對(duì)較少，且形

8、態(tài)正常;中藥組:骨小梁相較正常組稀疏，形態(tài)尚可，成骨細(xì)胞活躍。4周時(shí)模型組空骨陷窩率為(17.24±1.08)％，正常組(5.33±0.96)％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，中藥組4周時(shí)組織學(xué)觀察與模型組無明顯差異，8周及12周檢測(cè)可見成骨細(xì)胞活躍，骨小梁形態(tài)較前完整，空骨陷窩率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　3.HRMRI掃描分析:T1WI可見模型組股骨頭內(nèi)存在明顯低信號(hào)帶;中藥組在股骨頭內(nèi)近骨骺處存在小斑片

9、樣低信號(hào)改變，但大部分骨組織的灰度值正常。HRMRI結(jié)構(gòu)參數(shù)分析結(jié)果顯示，模型組與正常組相比，前者的ROE值（即壞死水腫區(qū)面積）增加，ROE/NR比例升高，中藥組與模型組相比，中藥組的ROE值減少，ROE/NR的比例下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示活血祛瘀法可促進(jìn)激素性股骨頭壞死修復(fù)。
　　4.Micro-CT掃描分析:在各時(shí)間節(jié)點(diǎn)分別取各組兔左側(cè)股骨頭行Micro-CT檢測(cè)，表觀可見模型組骨小梁較正常組稀疏，部分?jǐn)嗔?/p>

10、。中藥組與模型組相比，骨質(zhì)改善，骨小梁存在局部性修復(fù)。Micro-CT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，模型組與正常組相比，前者BV、Conn.D.、SMI、Tb.N、Tb.Th值降低，BV/TV比例下降，BS/BV、SMI、Tb.Sp值升高。中藥組與模型組相比，前者BV、Conn.D.、SMI、Tb.N值升高，BV/TV比例增加，BS/BV、Tb.Sp、Tb.Th值下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　5.SIONFH相關(guān)蛋白檢測(cè):Wester

11、n blot檢測(cè)RANK、RANKL、ABCB1、RUNX2、VEGF、OPN、PPARγ、OPG的蛋白表達(dá)。與模型組相比，中藥組RUNX2、OPG表達(dá)上調(diào)而RANK、RANKL表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），而模型組相較于正常組，其RANK、RANKL、RUNX2蛋白均上調(diào)，OPG蛋白表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與模型組相比，中藥組的ABCB1蛋白表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而模型組ABCB1的蛋白表達(dá)相較正

12、常組下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;相對(duì)于正常組，模型組內(nèi)VEGF的蛋白表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。相對(duì)于模型組，中藥組VEGF的蛋白上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各組間OPN和PPARγ的蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　6.臨床病例療效評(píng)價(jià):本研究36例患者64髖中，42髖與治療前相比，壞死水腫區(qū)面積減小(42/64)。至隨訪2年，未塌陷29髖中8髖塌陷，塌陷率27.6％(8

13、/29)，塌陷時(shí)間3個(gè)月～14個(gè)月，平均塌陷時(shí)間8.7個(gè)月。其中塌陷＜2mm者4例;2mm～4mm者3例;＞4mm者1例。治療前、服藥3個(gè)月、6個(gè)月、1年、2年Harris評(píng)分分別為:81.5±10.8、83.7±9.1、87.3±4.7、87.5±7.8、79.4±5.2。其中服藥6個(gè)月、1年與服藥前相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　7.三維重建MRI表現(xiàn)與臨床癥狀相關(guān)性分析:股骨頭壞死中壞死體積、壞死病灶總表面積、壞

14、死體積比、承重壞死區(qū)面積與Harris評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(r=0.171，P＜0.05; r=0.288，P＜0.05; r=0.452，P＜0.01; r=0.452，P＜0.01)。硬化區(qū)體積、承重硬化區(qū)面積與Harris評(píng)分呈正相關(guān)（r=-0.321，P＜0.01; r=0.452，P＜0.01）。
　　結(jié)論:
　　1.活血祛瘀法治療兔SIONFH后，HRMRI及Micro-CT顯示，兔股骨頭內(nèi)壞死骨小梁結(jié)構(gòu)改建優(yōu)于自然修復(fù)

15、，說明活血祛瘀法能夠改善SIONFH影像學(xué)表現(xiàn)。病理切片HE染色顯示，在12周結(jié)束時(shí)3組病理改變差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說明活血祛瘀法能夠促進(jìn)兔SIONFH修復(fù)，12周時(shí)趨于修復(fù)完全。
　　2.2周時(shí)HRMRI即出現(xiàn)壞死征象，并經(jīng)過病理驗(yàn)證壞死發(fā)生，同期Micro-CT未出現(xiàn)骨小梁形態(tài)及骨密度明顯改變。實(shí)驗(yàn)表明，HRMRI與Micro-CT作為高分辨率影像技術(shù)均能有效評(píng)價(jià)活血祛瘀法治療兔SIONFH療效，但HRMRI對(duì)股

16、骨頭壞死診斷要早于Micro-CT，與臨床實(shí)踐相符合。
　　3.Micro CT顯示，中藥組相較于模型組BV、Conn.D.、SMI、Tb.N值升高，BS/BV、Tb.Sp值降低，但Tb.Th值下降。說明活血祛瘀法治療可增高骨密度，促進(jìn)修復(fù)，但未能使骨量明顯增加。
　　4.中藥組相較于模型組，除RANK、RANKL表達(dá)水平下調(diào)外，其余均為上調(diào);而模型組與正常組相比，RANK、RANKL、RUNX2的蛋白表達(dá)上調(diào)，OPG、AB

17、CB1、VEGF的蛋白表達(dá)下調(diào)。說明活血祛瘀法促進(jìn)壞死修復(fù)的機(jī)制可能與抑制RANK、RANKL表達(dá)，促進(jìn)ABCB1、OPG、VEGF、RUNX2表達(dá)有關(guān)。
　　5.“活血祛瘀法”可改善未塌陷SIONFH患者Harris評(píng)分，維持髖關(guān)節(jié)基本功能。同時(shí)三維重建MRI表現(xiàn)與臨床癥狀相關(guān)性分析顯示:股骨頭壞死中壞死體積、壞死病灶總表面積、壞死體積比、承重壞死區(qū)面積與Harris評(píng)分呈負(fù)相關(guān);硬化區(qū)體積、承重硬化區(qū)面積與Harris評(píng)分呈正