腎缺血再灌注損傷心內(nèi)氧化應(yīng)激水平及細(xì)胞外超氧化物歧化酶的表達(dá)變化.pdf

1、腎缺血再灌注損傷（Renal ischemia reperfusion injury, RIRI)是臨床上腎臟手術(shù)治療時(shí)的一種病理現(xiàn)象。RIRI的發(fā)生可延遲術(shù)后患者腎臟功能的恢復(fù)，嚴(yán)重的可導(dǎo)致手術(shù)失敗以及腎功能衰竭。已有實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)：腎臟在血流被阻斷時(shí)會(huì)誘發(fā)不同部位的組織細(xì)胞損傷，當(dāng)血液灌注恢復(fù)時(shí)會(huì)有大量活性氧族（reactive oxygen species：ROS)形成并從腎組織細(xì)胞釋放出來(lái)，進(jìn)一步加重已有的細(xì)胞損傷，從而引發(fā)腎缺血

2、再灌注損傷的發(fā)生。因此，氧化應(yīng)激被認(rèn)為可能是導(dǎo)致RIRI發(fā)生的主要機(jī)制之一。
　　超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutases，SOD）有三種亞型，錳-超氧化物歧化酶（Mn-SOD）、銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)、細(xì)胞外超氧化物歧化酶（extracellular SOD, EC-SOD)。 EC-SOD是清除細(xì)胞外ROS的SOD亞型。以往對(duì)于Cu/Zn-SOD和Mn-SOD的抗氧化功能研究較多。但最近研究

3、發(fā)現(xiàn)：與Cu/Zn-SOD和Mn-SOD相比， EC-SOD可能在抗氧化應(yīng)激和抗炎等方面發(fā)揮了更加重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)：心肌組織內(nèi)EC-SOD表達(dá)量的降低，可明顯增加患者高血壓和缺血性心肌疾病的發(fā)病率。EC-SOD與胞外基質(zhì)結(jié)合力下降，心血管和缺血性心臟疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)也會(huì)明顯增加。此外，EC-SOD在心臟衰竭患者的表達(dá)水平也是明顯降低的。以上這些研究表明：EC-SOD在維持心肌正常功能中可能具有重要作用。
　　心臟是血液循環(huán)的動(dòng)力

4、器官，為維持其正常功能需消耗大量的氧氣與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。因此，心臟對(duì)缺血缺氧反應(yīng)十分敏感。當(dāng)腎組織發(fā)生缺血再灌注損傷并處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，心肌組織是否也會(huì)因氧化應(yīng)激反應(yīng)而誘發(fā)過(guò)氧化損傷？心肌EC-SOD的表達(dá)是否改變。
　　目的：探求RIRI后心肌組織EC-SOD基因和蛋白表達(dá)水平是否發(fā)生改變，這種改變與H2O2含量、MDA含量是否具有相關(guān)性。
　　方法：
　　1 RIRI動(dòng)物模型的建立及檢測(cè)標(biāo)本的處理
　　購(gòu)于河北醫(yī)

5、科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的雄性Wister大鼠（體重200±10 g）12只，隨機(jī)分為對(duì)照組（Control組）和腎臟缺血再灌注損傷模型組(RIRI組)。按照余曉東等人的模型制備方法建立RIRI實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型：腹腔注射6％水合氯醛（5ml/kg）麻醉大鼠。將RIRI組大鼠固定于手術(shù)臺(tái)上，酒精消毒后開腹充分暴露雙側(cè)腎臟，先將大鼠的右側(cè)腎臟切除后,再鈍性地分離其左側(cè)腎動(dòng)脈,并采用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾于腎門內(nèi)側(cè)約0.5cm處夾閉左腎動(dòng)脈，夾閉后腎臟顏色由鮮紅變

6、為淺紅，表明腎臟血液供應(yīng)被阻斷成功。血液供應(yīng)阻斷45分鐘后，松開動(dòng)脈夾，可觀察到左側(cè)腎動(dòng)脈迅速充盈,腎臟顏色也隨即由淺紅色轉(zhuǎn)變?yōu)轷r紅色,提示左側(cè)腎臟的血液重新灌注成功。Control組大鼠的消毒開腹過(guò)程與RIRI模型組一致，但該組大鼠雙側(cè)腎臟暴露后只切除其右側(cè)腎臟,鈍性地分離左側(cè)腎動(dòng)脈,但并不夾閉阻斷血液灌注?；謴?fù)大鼠腎臟血流灌注24小時(shí)后重新麻醉大鼠，收集右頸總動(dòng)脈血液，離心后吸取上層血清，凍存后用于檢測(cè)肌酐（Serum Creati

7、nine，SCr）、尿素氮（Blood Urea Nitrogen，BUN）含量；先摘取大鼠腎臟，生理鹽水清洗后，固定于4%多聚甲醛溶液中，采用HE染色法觀察大鼠腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。后摘取心臟，將切取的心臟迅速置于液氮中，待冷凍后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫糜跈z測(cè)大鼠心肌組織EC-SOD基因和蛋白表達(dá)水平，以及丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量和過(guò)氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）含量檢測(cè)。

8、r>　　2測(cè)定指標(biāo)及檢測(cè)方法
　　2.1大鼠血清中SCr和BUN含量檢測(cè)
　　大鼠血清中SCr和BUN含量分別采用苦味酸和酶偶聯(lián)速率法測(cè)定。SCr和BUN含量的測(cè)定過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。
　　2.2大鼠腎臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變的觀察
　　采用HE染色法觀察腎臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變。將4%多聚甲醛固定的腎臟標(biāo)本用梯度（50℅→100℅）乙醇進(jìn)行脫水、兩道二甲苯進(jìn)行透明，最后用熔化的石蠟進(jìn)行浸蠟和包埋處理。將包埋

9、后的腎臟標(biāo)本塊，修塊后切片，厚度約5μm，將切片撈于載玻片上，梯度（100℅→50℅）乙醇至水，然后進(jìn)行蘇木精伊紅染色，染色、分色后梯度（50℅→100℅）乙醇進(jìn)行脫水，二甲苯透明樹膠封片。Olympus光學(xué)顯微鏡觀察腎組織形態(tài)學(xué)改變并拍照。
　　2.3大鼠心肌組織中MDA含量檢測(cè)
　　按照10mg/100μl的比例向冰凍的心肌組織內(nèi)加入預(yù)冷的勻漿緩沖液。勻漿緩沖液構(gòu)成：磷酸鉀50mmol/L，苯甲基磺酰氟1mmol/L，苯

10、甲脒1mmol/L，吐溫-200.1%，氯化鈉0.5mol/L，乙二胺三乙酸三鈉1mmol/L，β-巰基乙醇5mmol/L，PH7.4。冰水混合物容器內(nèi)勻漿，然后將勻漿液4℃、4000轉(zhuǎn)/分，離心20分鐘，收集上清液即為10％大鼠心肌組織勻漿，其MDA含量采用巴比妥酸比色法檢測(cè)，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程按照南京建成MDA測(cè)定試劑盒的操作指南進(jìn)行。
　　2.4大鼠心肌中H2O2含量檢測(cè)
　　勻漿緩沖液構(gòu)成：磷酸鉀50mmol/L，苯甲基磺

11、酰氟1mmol/L，苯甲脒1mmol/L，吐溫-200.1%，氯化鈉0.5mol/L,乙二胺三乙酸三鈉1mmol/L，β-巰基乙醇5mmol/L，PH7.4。向預(yù)冷的勻漿緩沖液中加入冰凍的心肌組織，使其濃度為10mg/100μl，冰水混合物容器內(nèi)勻漿，然后將勻漿液4℃、4000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，收集上清液，此時(shí)制成含大鼠心肌組織10％的勻漿液。心肌勻漿液內(nèi)H2O2含量采用鉬酸比色法測(cè)定，以每克心肌蛋白所含H2O2的量表示心肌組織中H2

12、O2的含量（mmol/g pro）。
　　2.5大鼠心肌組織EC-SOD基因水平表達(dá)檢測(cè)
　　采用TRIzol試劑裂解大鼠心肌組織提取其中的總RNA。RNA定量后，采用3μg RNA反轉(zhuǎn)錄成模板cDNA。選取磷酸甘油醛脫氫酶(reduced glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)參照，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物跑瓊脂糖凝膠電泳，拍照測(cè)量擴(kuò)增產(chǎn)物條帶灰度值，采用EC-SO

13、D擴(kuò)增產(chǎn)物與內(nèi)參照 GAPDH擴(kuò)增產(chǎn)物的灰度值比，來(lái)表示EC-SOD基因的相對(duì)表達(dá)量。
　　2.6大鼠心肌組織EC-SOD蛋白水平表達(dá)檢測(cè)
　　采用Western blotting（免疫印跡法）測(cè)定大鼠心肌組織EC-SOD蛋白水平的相對(duì)表達(dá)量。冰水混合物容器內(nèi)將大鼠心肌組織勻漿,勻漿液離心（3000rpm），取上清、煮沸，使其蛋白變性，采用改良Lowry法進(jìn)行蛋白定量。聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白上樣量為65 ug，轉(zhuǎn)膜后5％脫脂

14、奶粉封閉處理,將5％脫脂奶粉稀釋的兔抗EC-SOD抗體（一抗）滴加到PVDF膜上，將其置于搖床4℃震蕩過(guò)夜。經(jīng)Tween-TBS漂洗液洗膜兩次后，滴加熒光標(biāo)記的二抗（抗兔IgG）。條帶選用雙色紅外線成像系統(tǒng)掃描并對(duì)其灰度值進(jìn)行分析。
　　2.7大鼠心肌EC-SOD mRNA、蛋白表達(dá)水平與MDA含量、H2O2含量相關(guān)性分析
　　采用Pearson相關(guān)性統(tǒng)計(jì)法分析大鼠心肌EC-SOD mRNA、蛋白表達(dá)水平與MDA含量、H2O

15、2含量的相關(guān)性
　　結(jié)果：
　　1大鼠腎組織的HE觀察結(jié)果
　　HE法觀察大鼠腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變。對(duì)照組大鼠腎組織光鏡下可見(jiàn)：腎小球、腎小囊形態(tài)正常未見(jiàn)血管球萎縮囊腔擴(kuò)張，近、遠(yuǎn)曲小管以及集合管的形態(tài)結(jié)構(gòu)未見(jiàn)異常，腎間質(zhì)結(jié)構(gòu)規(guī)整無(wú)異常。而RIRI組大鼠腎組織光鏡下可見(jiàn)：腎小體、腎小管之間的間隙擴(kuò)大；腎血管球萎縮、體積縮?。荒I小囊的囊腔增寬變大；近、遠(yuǎn)曲小管以及集合管的管壁細(xì)胞萎縮體積變小，管腔明顯擴(kuò)張。心肌組織在光學(xué)顯

16、微鏡下兩組間未見(jiàn)明顯形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。
　　2大鼠血清SCr含量
　　腎缺血再灌注損傷組大鼠血清SCr含量為131.153±17.814μmol/L，正常對(duì)照組大鼠血清SCr含量為103.444±8.465μmol/L，兩組相比腎缺血再灌注損傷組大鼠血清SCr含量升高（P<0.05）。
　　3大鼠血清BUN含量
　　腎缺血再灌注損傷組大鼠血清BUN含量為13.685±4.397 mmol/L，正常對(duì)照組大鼠血清BUN

17、含量為4.462±0.541 mmol/L，兩組相比，腎缺血再灌注損傷組大鼠血清BUN含量升高明顯（P<0.05）。
　　4大鼠心肌組織中MDA含量
　　腎缺血再灌注損傷組大鼠心肌組織MDA含量為14.01±2.29 mmol/g，正常對(duì)照組大鼠心肌組織MDA含量為10.18±1.77mmol/g，兩組相比，腎缺血再灌注損傷組大鼠心肌組織MDA含量升高（P<0.01）。
　　5大鼠心肌組織中H2O2含量
　　腎缺

18、血再灌注損傷組大鼠心肌組織H2O2含量為18.56±2.56 mmol/g，正常對(duì)照組大鼠心肌組織H2O2含量為13.93±1.88 mmol/g，兩組相比，腎缺血再灌注損傷組大鼠心肌組織H2O2含量升高（P<0.01）。
　　6心肌組織EC-SOD基因的表達(dá)改變
　　RT-PCR法測(cè)定大鼠心肌組織EC-SOD的mRNA相對(duì)表達(dá)水平， GAPDH作為擴(kuò)增內(nèi)對(duì)照。與對(duì)照組大鼠心肌組織EC-SOD mRNA表達(dá)量（0.73±0.

19、11）相比，腎缺血再灌注損傷組大鼠心肌組織EC-SOD mRNA表達(dá)水平（1.15±0.17）明顯升高，（P<0.01）。此結(jié)果表明：腎缺血再灌注損傷發(fā)生后，RIRI組大鼠心肌組織EC-SOD基因表達(dá)水平明顯增強(qiáng)。
　　7心肌組織EC-SOD的蛋白表達(dá)改變
　　免疫印跡法檢測(cè)蛋白水平EC-SOD相對(duì)表達(dá)量，腎缺血再灌注損傷組大鼠心肌組織EC-SOD蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.07±0.12，正常對(duì)照組大鼠心肌組織EC-SOD蛋白相對(duì)

20、表達(dá)量為0.65±0.1，兩組相比，腎缺血再灌注損傷組大鼠心肌組織EC-SOD蛋白相對(duì)表達(dá)量增強(qiáng)（P<0.01）。此結(jié)果表明：腎缺血再灌注損傷發(fā)生后，RIRI組大鼠心肌組織EC-SOD的蛋白表達(dá)水平也是增強(qiáng)的。
　　8心肌EC-SOD mRNA、蛋白表達(dá)水平與MDA、H2O2含量的相關(guān)性
　　Pearson統(tǒng)計(jì)法分析大鼠心肌EC-SOD mRNA、蛋白表達(dá)水平與MDA含量、H2O2含量的相關(guān)性。心肌EC-SOD mRNA表達(dá)