二甲雙胍通過降低miR-34a抵抗心肌缺血再灌注損傷.pdf

1、心肌缺血再灌注損傷是急性心肌梗死病人進(jìn)行溶栓或經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（Percutanious coronary intervention，PCI）之后心肌損傷的重要原因，是血管再次開通引起的心肌繼發(fā)損傷，目前尚無有效的緩解辦法。雖然缺血后適應(yīng)法被認(rèn)為有一定的緩解作用，但操作復(fù)雜，可控性差，仍不能完全避免再灌注損傷。因此，研究探討緩解心肌缺血再灌注損傷的有效方法有重要的臨床應(yīng)用意義。
　　心肌缺血再灌注損傷涉及心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)、氧化

2、應(yīng)激、線粒體損傷、自噬、凋亡等方面，但其具體分子機(jī)制仍未研究清楚。
　　microRNA作為一種廣泛表達(dá)于所有組織和個(gè)體各個(gè)發(fā)展階段，調(diào)節(jié)各種生理病理過程的功能性小分子，也參與了心血管疾病如心肌肥大，心衰、心肌梗死等的調(diào)節(jié)過程。凋亡是microRNA的一個(gè)常見的調(diào)控過程。研究顯示，促凋亡的p53蛋白在轉(zhuǎn)錄水平直接上調(diào)miR-34a的表達(dá)；抑制凋亡的Bcl-2的mRNA是miR-34a的靶分子。在腫瘤細(xì)胞中，p53能夠通過增加miR

3、-34a的表達(dá)而降低Bcl-2的表達(dá)，進(jìn)而增加腫瘤細(xì)胞的凋亡，起到抗腫瘤的作用。然而，我們前期研究發(fā)現(xiàn)，大鼠心肌細(xì)胞株H9C2經(jīng)氧糖剝奪再灌注（模擬缺血再灌注）損傷后，細(xì)胞中miR-34a水平明顯增加。此時(shí)增加的miR-34a是否也與引起心肌缺血再灌注損傷的凋亡有關(guān)？未見報(bào)道。
　　二甲雙胍是國(guó)際用藥指南推薦的安全性高、副反應(yīng)較少治療2型糖尿病的一線口服藥物。除了通過抑制肝糖異生和葡萄糖釋放起到降低血糖的作用外，還能夠:
　

4、?。?）通過調(diào)節(jié)microRNA的表達(dá)對(duì)腫瘤起到抑制作用。例如，二甲雙胍增加Let-7表達(dá)抑制乳腺癌，增加miR-26a抑制胰腺癌等；
　?。?）對(duì)心血管有保護(hù)作用例如，二甲雙胍可以降低所2型糖尿病患者全原因死亡率、心梗發(fā)生率；減少心?；颊吆蛯?shí)驗(yàn)動(dòng)物心肌梗死的面積與血清心肌酶水平；促進(jìn)梗死后心肌的重塑。二甲雙胍是否也對(duì)心肌的缺血再灌注損傷有保護(hù)作用？如有保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)制如何？是否與其促凋亡而抑制腫瘤的機(jī)制相反，是通過降低miR

5、-34a抑制凋亡而實(shí)現(xiàn)的？未見報(bào)道。
　　為了探討上述問題，本文分別以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，心肌細(xì)胞和臨床標(biāo)本為對(duì)象，進(jìn)行以下三部分研究：
　　（1）二甲雙胍對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用；
　?。?）二甲雙胍對(duì)大鼠H9C2心肌細(xì)胞氧糖剝奪再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究；
　　（3）二甲雙胍對(duì)急性心肌梗死后行經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療的糖尿病患者心肌的保護(hù)作用。
　　第一部分：二甲雙胍對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

6、
　　目的：
　?。?）探討miR-34a在心肌缺血再灌注損傷中的作用；
　?。?）二甲雙胍是否對(duì)缺血再灌注損傷有保護(hù)？是否與miR-34a關(guān)聯(lián)？
　　方法：
　　1.通過結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支（Left anterior descending，LAD）再開通建立大鼠/小鼠心肌缺血再灌注損傷模型。
　　2.通過心肌TTC及Evans’藍(lán)染色、心電圖、蘇木精-伊紅(HE)染色血清心肌酶測(cè)定，觀察心肌損傷。

7、
　　3.通過心肌組織石蠟切片TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡發(fā)生；RT-qPCR檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、p53的mRNA表達(dá)水平；western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、p53、caspase3和cleaved caspase3的蛋白表達(dá)水平。
　　4.進(jìn)行相關(guān)性分析，證明本實(shí)驗(yàn)條件下心肌缺血再灌注損傷是否與凋亡的發(fā)生相關(guān)；心肌細(xì)胞的凋亡是否又與miR-34a的增加關(guān)聯(lián)。
　　5.大鼠心肌缺血之后，于開通血

8、管再灌注的同時(shí)頸靜脈給予二甲雙胍（3 mg/kg），用上述方法和指標(biāo)，觀察二甲雙胍是否降低了心肌miR-34a的水平、減少了心肌細(xì)胞凋亡和心肌損傷。
　　結(jié)果：
　　1.成功建立大鼠/小鼠心肌缺血再灌注損傷模型
　　SD大鼠及C57BL/6J小鼠心肌缺血再灌注后，在LAD供血處心肌出現(xiàn)白色梗死區(qū)域；大鼠心電圖的ST段抬高，血清心肌酶明顯增加（P<0.05）；大鼠LAD供血處心肌組織的肌纖維排列不規(guī)則，紋理模糊，出現(xiàn)多處

9、纖維溶解、斷裂，肌漿凝聚深染。結(jié)果表明，心肌缺血再灌注損傷模型建立。
　　2.心肌缺血再灌注損傷與心肌細(xì)胞凋亡增加有關(guān)
　　TUNEL染色結(jié)果顯示鼠心肌缺血再灌注損傷后，凋亡的心肌細(xì)胞比例增加了近十倍（P<0.01）。心肌細(xì)胞中抑制凋亡的Bcl-2及促凋亡的p53的mRNA及蛋白表達(dá)水平分別降低和增加（P<0.01）；凋亡的執(zhí)行蛋白Caspase3的活化形式Cleaved caspase3增加。結(jié)果說明，缺血再灌注損傷后心肌

10、細(xì)胞凋亡增加。血清CK-MB水平與凋亡細(xì)胞的比例有較強(qiáng)的正相關(guān)（r=0.8657，P<0.01）。說明心肌損傷與心肌細(xì)胞的凋亡有關(guān)。
　　3.心肌缺血再灌注引起的細(xì)胞凋亡與miR-34a水平增加有關(guān)
　　心肌缺血再灌注損傷后，不僅心肌的miRNA-34a水平升高（P<0.05），而且，增加的miR-34a的水平與其下游靶基因，抑制凋亡的Bcl-2的mRNA水平有一定的負(fù)相關(guān)（r=-0.499，P<0.01），與其上游的調(diào)控蛋

11、白，促凋亡的p53的蛋白水平和凋亡的細(xì)胞比例（r=0.5024，P<0.01）有較強(qiáng)的正相關(guān)（r=0.7599，P<0.01）。結(jié)果說明，缺血再灌注損傷后，細(xì)胞可能通過增加p53的表達(dá)上調(diào)miR-34a表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)miR-34a的下游靶基因Bcl-2的表達(dá)，增加凋亡。
　　4.二甲雙胍可減少心肌細(xì)胞凋亡，減少心肌缺血再灌注損傷
　　二甲雙胍可劑量依賴性地減少SD大鼠缺血再灌損傷的心肌梗死面積（P<0.05），減輕心肌纖維的

12、不規(guī)則排列，降低血清心肌酶的活性（P<0.05），減少細(xì)胞凋亡的比例（P<0.01）。與此同時(shí)，二甲雙胍也降低了miR-34a的表達(dá)，上調(diào)了抑制凋亡的Bcl-2、下調(diào)促凋亡的p53的mRNA與蛋白表達(dá)水平，減少cleaved caspase3的蛋白水平，（P<0.05）。結(jié)果表明，二甲雙胍可通過降低細(xì)胞的凋亡而保護(hù)缺血再灌心肌，這一保護(hù)作用可能與下調(diào)miR-34a有關(guān)。
　　小結(jié)：
　　1.心肌缺血再灌注后，伴隨miR-34

13、a的增加，心肌細(xì)胞的凋亡增加，導(dǎo)致了心肌功能損傷；
　　2.二甲雙胍可下調(diào)miR-34a，減少心肌細(xì)胞的凋亡而改善心肌缺血再灌注損傷。
　　第二部分：二甲雙胍抵抗大鼠H9C2心肌細(xì)胞氧糖剝奪再灌注損傷的作用及其機(jī)制
　　目的：
　　證明二甲雙胍通過下調(diào)miR-34a而減輕心肌細(xì)胞凋亡，并探討其機(jī)制
　　方法：
　　1.通過氧糖剝奪再灌注的方法，使H9C2心肌細(xì)胞受到類似整體的缺血再灌注損傷（氧糖剝奪6

14、 h、再灌注2 h）。
　　2.用TUNEL染色和流式細(xì)胞儀檢測(cè)心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡的比例；用RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)miR-34a、Bcl-2的mRNA表達(dá)水平；用Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、caspase3及其活化形式cleaved caspase3的蛋白水平。
　　3.將miR-34a mimic與inhibitor分別轉(zhuǎn)染入H9C2細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)或敲低miR-34a后，觀察不同轉(zhuǎn)染時(shí)間或不同轉(zhuǎn)染濃度

15、條件下上述指標(biāo)的改變。
　　4.氧糖剝奪后再灌注的同時(shí)，給予二甲雙胍處理，用MTS法確定二甲雙胍的濃度，觀察二甲雙胍對(duì)細(xì)胞內(nèi)pre-miR-34a、miRNA34a、p53 mRNA的表達(dá)水平，caspase3及其活化形式、Bcl-2、 p53和SIRT1的蛋白表達(dá)水平，以及SIRT1去乙?；富钚宰兓挠绊?。
　　結(jié)果：
　　1.氧糖剝奪再灌注使H9C2大鼠心肌細(xì)胞受到類似心肌缺血再灌注損傷：
　　a.H9C2

16、凋亡細(xì)胞比例明顯增加（P<0.001）；b.伴隨miR-34a水平增加，凋亡相關(guān)的Bcl-2 mRNA和蛋白水平下降，Cleaved Caspase3的蛋白水平增加（P<0.01）。結(jié)果表明，氧糖剝奪再灌注在H9C2細(xì)胞中模擬了心肌缺血再灌注的損傷。
　　2.氧糖剝奪再灌注（OGD/R）引起的細(xì)胞凋亡與miR-34a水平的增加有關(guān)
　　TUNEL染色顯示，分別用mimic和inhibitor過表達(dá)或敲低miR-34a后，H9

17、C2細(xì)胞的凋亡數(shù)，Bcl-2的mRNA及蛋白水平能夠隨之劑量和時(shí)間依賴性的增加或減少（P<0.001），凋亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspase3水平降低或增加（P<0.01）。說明miR-34a水平的增加確實(shí)可導(dǎo)致H9C2細(xì)胞的凋亡，與氧糖剝奪再灌注下心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。
　　3.二甲雙胍對(duì)H9C2發(fā)生氧糖剝奪再灌注損傷有抵抗作用。
　　二甲雙胍使OGD/R細(xì)胞的凋亡比例較減少；敲低miR-34a時(shí)可以達(dá)到類似二甲雙胍的治

18、療效果，如果同時(shí)給予二甲雙胍則可使凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)下降的更明顯。
　　4.二甲雙胍降低p53的表達(dá)和乙酰化水平，下調(diào)miR-34a的表達(dá)
　　在氧糖剝奪再灌注條件下，二甲雙胍雖對(duì)低表達(dá)的去乙?；窼IRT1蛋白水平?jīng)]影響，但使心肌細(xì)胞下降的SIRT1活性明顯上升，Ac-p53（Acetyl K381)的水平降低，p53的表達(dá)水平下降，以及pre-miR-34a的表達(dá)水平下調(diào)。
　　小結(jié)：
　　1.在氧糖剝奪再灌注

19、條件下，miR-34a表達(dá)上調(diào)是H9C2心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡的原因之一。
　　2.二甲雙胍不僅下調(diào)了p53的表達(dá)，還通過上調(diào)去乙?；窼IRT1的活性減少了轉(zhuǎn)錄活性的Ac-p53量，進(jìn)而下調(diào)了miR-34a的表達(dá)。
　　第三部分：二甲雙胍對(duì)糖尿病患者急性心肌梗死后行經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入損傷的抵抗作用
　　目的：
　　探討患者心肌缺血再灌注損傷與血清miR-34a的關(guān)系以及二甲雙的影響
　　方法：
　　1.隨機(jī)

20、選取急性ST段抬高的心肌梗死后行PCI的病人90例，檢測(cè)PCI術(shù)前術(shù)后靜脈血中心肌酶CKMB活性，以及miRNA34a水平，行術(shù)前和術(shù)后90 min標(biāo)準(zhǔn)12導(dǎo)聯(lián)心電圖檢測(cè)，人工測(cè)量所有導(dǎo)聯(lián)的ST段相對(duì)于基線的抬高值，將各導(dǎo)聯(lián)抬高值相加后即為ST段升高值總和。
　　2.選出術(shù)前心梗位置（V1-V6導(dǎo)聯(lián)ST段抬高）和程度（V1-V6導(dǎo)聯(lián)ST段抬高值總和）相同的患者，分成四組：
　?。?）在發(fā)病前只服用二甲雙胍的患者;
　　

21、（2）只服用他汀類藥物的患者;
　?。?）同時(shí)服用二甲雙胍與他汀類藥物的患者;
　?。?）這兩種藥物均不服用的患者。分析miRNA34a水平，與相應(yīng)ST段升高值總和及CKMB水平的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　1.PCI術(shù)后患者ST段升高總值下降。表明，術(shù)后心功能改善。
　　2.PCI術(shù)后患者CKMB活性升高。表明，術(shù)后有心肌缺血再灌注損傷。
　　3.PCI術(shù)后患者血清miR-34a升高，并與CKMB活性

22、正相關(guān)（r=0.4557，P<0.01）,與術(shù)前與術(shù)后ST段升高值總和之差負(fù)相關(guān)。（r=-3404，P<0.001）。表明，miR-34a與心肌缺血再灌注損傷相關(guān)。
　　4.服用二甲雙胍組患者的miR-34a水平除了與同時(shí)服用二甲雙胍和他汀藥物的患者無區(qū)別（P=0.3965>0.05）外，均低于單服用他汀類藥物（P<0.001），服用其他糖尿病治療藥物（P<0.05），以及服用其他非糖尿病治療藥物（P<0.05）三組的患者。表明，

23、二甲雙胍可降低心肌缺血再灌注導(dǎo)致的miR-34a水平增加。
　　小結(jié)：
　　心肌梗死患者行PCI術(shù)前術(shù)后體內(nèi)血清miR-34a水平與心肌損傷相關(guān)。二甲雙胍通過影響miR-34a表達(dá)水平對(duì)心肌缺血再灌注損傷有保護(hù)作用。
　　結(jié)論：
　　1.心肌缺血再灌注后會(huì)發(fā)生心肌損傷，此過程與心肌細(xì)胞凋亡增加相關(guān)，而凋亡增加是與miR-34a相關(guān)的。二甲雙胍可通過下調(diào)p53蛋白表達(dá)進(jìn)而降低miRNA34a的表達(dá)，使其下游靶基因B

24、cl-2的mRNA及蛋白表達(dá)水平降低，最終引起凋亡蛋白Caspase3及其活化形式減少，表現(xiàn)為心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生減少。
　　2.二甲雙胍通過上調(diào)去乙?；窼IRT1的活性，減少p53在mRNA和蛋白上的表達(dá)水平；而p53作為miR-34a的上游調(diào)控蛋白，當(dāng)它的表達(dá)下調(diào)時(shí)，miR-34a的表達(dá)也就相應(yīng)下調(diào)，進(jìn)而減少了缺血再灌注損傷引起的細(xì)胞凋亡。
　　3.心肌梗死患者行PCI術(shù)前術(shù)后體內(nèi)血清miR-34a水平與心肌損傷相關(guān)。二甲