根瘤菌內(nèi)源質(zhì)粒的屬間轉(zhuǎn)移及多樣性的研究.pdf

1、本研究采用Tn5-mob-sacB轉(zhuǎn)座子對(duì)含有三個(gè)內(nèi)源質(zhì)粒的華癸中生根瘤菌2020和含有兩個(gè)內(nèi)源質(zhì)粒的華癸中生根瘤菌7653R進(jìn)行質(zhì)粒標(biāo)記，獲得2020和7653R的質(zhì)粒標(biāo)記菌株。利用sacB基因?qū)φ崽堑拿舾行赃M(jìn)行標(biāo)記質(zhì)粒的消除，獲得2020和7653R的質(zhì)粒消除突變株2020D29，2020D8和7653RD。其中2020D29為2020的第一大質(zhì)粒p2020c消除的突變株，2020D8為第二大質(zhì)粒p2020b消除的突變株，7653R

2、D是7653R共生質(zhì)粒被消除的突變株，2020的第三大質(zhì)粒p2020a和7653R的第二大質(zhì)粒7653Ra很難被消除，原因可能是這兩個(gè)質(zhì)粒上含有菌株生長(zhǎng)所必需的基因。對(duì)2020及其質(zhì)粒缺失突變株共生固氮能力的研究結(jié)果表明：2020第一大質(zhì)粒p2020c的消除可顯著增強(qiáng)突變株2020D29的共生固氮效率，第二大質(zhì)粒p2020b的消除則使突變株2020D8失去結(jié)瘤能力。
　　 將豌豆根瘤菌T83K3的共生質(zhì)粒pJB5JI轉(zhuǎn)入華癸中生

3、根瘤菌2020和7653R及它們的質(zhì)粒缺失突變株2020D29、2020D8和7653RD中。得到轉(zhuǎn)移接合子2020-137，2020D8-8。2020-122，2020D29-13，2020D8-80，7653R-197，7653RD35，7653R-15，7653R5。其中2020-137和2020D8-8及7653R-197和7653RD35中的外源質(zhì)粒的大小與pJB5JI一樣，其它幾個(gè)轉(zhuǎn)移接合子中的外源質(zhì)粒小于pJB5JI。將出

4、發(fā)菌株和所得到的轉(zhuǎn)移接合子進(jìn)行共生效率和競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤實(shí)驗(yàn)的測(cè)定，結(jié)果表明：2020-137和7653R-197的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤能力和固氮能力顯著高于2020和7653R，而且對(duì)于不含共生質(zhì)粒的受體菌2020D8和7653RD，pJB5JI也不能恢復(fù)它們?cè)谧显朴⑸辖Y(jié)瘤的能力，說(shuō)明豌豆根瘤菌的共生質(zhì)粒與供試根瘤菌的共生質(zhì)粒的功能不能互補(bǔ)。轉(zhuǎn)移接合子2020D8-8和7653RD35可以在豌豆上結(jié)白色的無(wú)效瘤，而含有內(nèi)源共生質(zhì)粒的接合子卻不能結(jié)瘤，表明

5、華癸中生根瘤菌的共生質(zhì)粒可能抑制pJB5JI功能的表達(dá)，后者可以在沒(méi)有共生質(zhì)粒的華癸中生根瘤菌的染色體背景下表達(dá)其結(jié)瘤功能，但固氮能力的表達(dá)可能還需要豌豆根瘤菌中其它基因的協(xié)同作用。對(duì)pJB5JI在受體中的穩(wěn)定性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明：pJB5JI可以在受體菌中穩(wěn)定傳代，但經(jīng)過(guò)與紫云英共生之后卻只能在部分根瘤分離物中檢測(cè)到pJB5JI。對(duì)供試轉(zhuǎn)移接合子和出發(fā)菌株及分離株進(jìn)行Km基因的PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)除出發(fā)受體菌外，其余菌株都可以得到PCR產(chǎn)

6、物，由此推斷，在沒(méi)有檢測(cè)到pJB5JI的分離株中，pJB5JI可能部分或全部整合到了受體根瘤菌的染色體DNA中。
　　 費(fèi)氏中華根瘤菌HN01含有三個(gè)內(nèi)源質(zhì)粒，其中第二大質(zhì)粒是HN01的共生質(zhì)粒，HND29是缺失了共生質(zhì)粒的突變株，HND28是缺失了第三大質(zhì)粒的突變株，HND100是同時(shí)缺失了第二和第三大質(zhì)粒的突變株。同時(shí)將pJB5JI轉(zhuǎn)入HN01和三個(gè)質(zhì)粒缺失突變株中，獲得轉(zhuǎn)移接合子HN01-35，HN01-92，HND29-

7、5，HND29-6，HND28-30，HND28-43，HND28-66，HND100-123等8個(gè)轉(zhuǎn)移接合子，其中HN01-92。HND29-6，HND28-30和HND100-123中的外源質(zhì)粒與pJB5JI的大小一樣，HN01-35，HND29-5和HND28-43中的外源質(zhì)粒小于pJB5JI，而HND28-66中有兩個(gè)外源質(zhì)粒，其中一個(gè)大小與pJB5JI一樣，另一個(gè)與T83K3中最小質(zhì)粒的大小相當(dāng)，這說(shuō)明，pJB5JI在轉(zhuǎn)移時(shí)帶

8、動(dòng)了另一個(gè)內(nèi)源質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移。同時(shí)將出發(fā)菌株和所得到的轉(zhuǎn)移接合子進(jìn)行共生效率和競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤實(shí)驗(yàn)的測(cè)定，結(jié)果表明：HN01-92和HND28-30的共生固氮能力和競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤能力與HN01和HND28相比沒(méi)有明顯變化，這與pJB5JI在華癸中生根瘤菌中的情況不同，說(shuō)明根瘤菌的共生固氮效率和競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤能力與外源質(zhì)粒和菌株本身的染色體基因都有關(guān)系；所有的轉(zhuǎn)移接合子都不能在豌豆上結(jié)瘤，表明豌豆根瘤菌的共生質(zhì)粒不能在費(fèi)氏中華根瘤菌的遺傳背景下表達(dá)。對(duì)pJB5J

9、I在受體中的穩(wěn)定性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明：pJB5JI可以在受體菌中穩(wěn)定傳代，并且在經(jīng)過(guò)與大豆共生之后，從接合子所結(jié)的根瘤中均檢測(cè)到外源質(zhì)粒，說(shuō)明外源質(zhì)粒在費(fèi)氏中華根瘤菌中無(wú)論是人工傳代還是與植物共生，都能穩(wěn)定存在。
　　 利用16S rRNA PCR-RFLP、16S rRNA基因全序列分析以及16S-23S rRNA IGS PCR-RFLP技術(shù)對(duì)分離自我國(guó)江蘇鹽城，浙江溫州，湖北仙桃及重慶等亞熱帶地區(qū)的42株豌豆根瘤菌進(jìn)行了遺

10、傳多樣性的研究。16S rRNA PCR-RFLP分析以及16SrRNA基因序列分析結(jié)果表明：所有供試豌豆根瘤菌可分為兩個(gè)類群，類群1包括XtP1在內(nèi)的40株豌豆根瘤菌和足R．leguminosarum USDA2370，為優(yōu)勢(shì)種群，占供試菌株的97％。類群2由WzP3和WzP15組成，與R．etli CFN42相近。16S-23S rRNAIGS PCR-RFLP研究結(jié)果表明：所有供試菌株分為18個(gè)基因型，在91％的相似性上分為四個(gè)類