鐵皮石斛多糖的分離純化及調(diào)節(jié)糖代謝紊亂的機(jī)制研究.pdf

1、糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是以機(jī)體糖代謝紊亂為特點(diǎn)的疾病，對人們的健康具有嚴(yán)重不良影響。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，在糖尿病患者人群中，Ⅱ型糖尿病是糖尿病的主要組成部分，占90％以上且具明顯上升趨勢，嚴(yán)重威脅著人們的健康。由于傳統(tǒng)的治療糖尿病的藥物具有嚴(yán)重肝腎毒性、低血糖、胃腸道等副作用,因此研究開發(fā)新的預(yù)防和治療糖尿病的天然藥品和保健食品具有重要意義。在尋找與開發(fā)新藥過程中發(fā)現(xiàn)，許多中藥多糖具有安全、無毒副作用的優(yōu)勢，

2、這使中藥多糖的研究越來越受到重視。近年來的研究表明，鐵皮石斛富含石斛多糖、石斛堿、氨基酸、芪類及其衍生物等活性成分，具有降血糖、降血脂、抗炎、抗衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等功效，而DOP是其發(fā)揮降低機(jī)體血糖的重要成分。目前已有DOP及其方劑用于預(yù)防、治療糖尿病的報道，但從分子水平探討DOP降糖作用機(jī)制的甚少。因此，深入研究DOP降糖活性，闡明其降糖作用機(jī)制變得十分重要。
　　本文以鐵皮石斛為原料，提取純化后得到性狀穩(wěn)定的DOP，在此基礎(chǔ)

3、上研究DOP對Ⅱ型糖尿病的治療及其作用機(jī)制，為DOP的臨床應(yīng)用和保健品的開發(fā)提供新的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　第一部分:鐵皮石斛多糖的分離及純化
　　采用宜昌鐵皮石斛為原料，經(jīng)水提醇沉法得到鐵皮石斛粗多糖。粗多糖溶液經(jīng)低濃度 H2O2脫色、反復(fù)凍融去除溶液中鞣酸及蛋白，所得多糖溶液經(jīng)透析袋透析除去蛋白質(zhì)及雜質(zhì)，最后通過 G50凝膠色譜柱進(jìn)行層析分離，冷凍干燥得到精制DOP(DOP)，苯酚-硫酸法檢測其糖含量為105%；高效凝膠滲

4、透色譜法(HPGPC)測定其重均分子質(zhì)量為1.264×105Da，且分子量均一；紫外掃描顯示DOP幾乎不含核酸和蛋白質(zhì)；PMP柱前衍生高效液相色譜法檢測其由葡甘露聚糖組成。以上結(jié)果顯示，本方法制備的DOP性狀良好，純度滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。
　　第二部分:鐵皮石斛多糖對Ⅱ型糖尿病小鼠的治療作用研究
　　采用HFD喂養(yǎng)聯(lián)合多次腹腔注射小劑量(STZ)的方法，誘導(dǎo)建立Ⅱ型糖尿病小鼠模型。隨機(jī)選取50只小鼠，給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)；另隨

5、機(jī)選取10只作為NC組，全程給予普通飼料喂養(yǎng)。高脂高糖飼料喂養(yǎng)4周后注射STZ（i.p.，q.w.d.，66mg/kg）。再4周后測定血糖，以空腹血糖FBG>11.1mmol/L為成功建立Ⅱ型糖尿病模型標(biāo)準(zhǔn)，造模成功率達(dá)90%。
　　取造模成功的小鼠，隨機(jī)分為4組，每組10只。分別設(shè)為模型組(灌胃給予等體積的生理鹽水，b.l.d.×28)，DOP低、中、高劑量組(分別灌胃給予DOP100mg/kg，200mg/kg，400mg/k

6、g，b.l.d.×28)。實(shí)驗(yàn)過程中定期觀察小鼠活動狀態(tài)，記錄體重及血糖。灌胃第25天進(jìn)行口服葡萄糖耐量（OGTT）試驗(yàn)，灌胃第28天測定糖尿病小鼠血清胰島素（FINS），血脂，肌肝糖原相關(guān)指標(biāo)及超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX)等相關(guān)抗氧化酶活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，給予 DOP后，給藥組小鼠精神狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，體重下降趨勢明顯減弱，血糖水平也較模型組明顯降低。同時，通過口服葡萄

7、糖耐量（OGTT）試驗(yàn)和胰島素抵抗評價指數(shù)（HOMA-IR）證實(shí)，DOP能夠顯著提高糖尿病小鼠對葡萄糖的耐受力，增加糖尿病小鼠血清胰島素水平和降低胰島素抵抗指數(shù)。此外，DOP能夠顯著降低糖尿病小鼠總膽固醇與甘油三酯水平，并低（100mg/kg）、中（200mg/kg）、高（400mg/kg）劑量組呈明顯的劑量依賴性，表明 DOP具有調(diào)節(jié)糖尿病小鼠血脂代謝紊亂的作用。給予DOP4周后，給藥鐵皮石斛干預(yù)治療組小鼠血清中GSH含量增加， GS

8、H-PX活力增強(qiáng)，SOD含量顯著增加，均表現(xiàn)為低（100mg/kg）、中（200mg/kg）、高（400mg/kg）劑量組顯著劑量依賴性；同時，DOP可顯著降低糖尿病小鼠MDA含量，低（100mg/kg）、中（200mg/kg）、高（400mg/kg）劑量組血脂降低水平呈明顯的劑量依賴性。以上結(jié)果證實(shí)，DOP能夠提高糖尿病小鼠體內(nèi)抗氧化物酶的活性和降低脂質(zhì)過氧化物的含量，從而增強(qiáng)清除自由基的能力和降低活性氧的產(chǎn)生，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激，防止氧

9、化損傷的作用。推測抗氧化應(yīng)激可能是DOP抗糖尿病和緩解胰島素抵抗的途徑之一。
　　第三部分:鐵皮石斛多糖調(diào)節(jié)糖代謝紊亂的機(jī)制研究
　　從組織形態(tài)學(xué)探討DOP調(diào)節(jié)糖代謝紊亂的作用機(jī)制。對糖尿病小鼠肝組織進(jìn)行HE染色、PAS染色，觀察糖尿病小鼠肝組織形態(tài)變化及定性檢測肝糖原含量。通過HE組織切片，空白對照組小鼠肝臟結(jié)構(gòu)完整，清晰。肝細(xì)胞排列規(guī)則，胞漿均勻，形態(tài)正常。模型組對照組小鼠肝細(xì)胞排列紊亂，有明顯的脂肪變性，出現(xiàn)明顯胞核和

10、胞漿分離的現(xiàn)象。給藥組小鼠肝細(xì)胞與模型組相比,結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞排列規(guī)則，肝細(xì)胞脂肪變性顯著減少且具有劑量依賴性；通過PAS組織切片，模型組小鼠肝細(xì)胞胞漿內(nèi)紫紅色顆粒較少，細(xì)胞排列松散。較模型組，給藥組肝細(xì)胞胞漿內(nèi)紫紅色顆粒明顯增多致密且具有劑量依賴性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過 DOP的治療，Ⅱ型糖尿病小鼠肝組織損傷在一定程度上得以修復(fù)且肝組織內(nèi)糖原含量明顯升高。從而揭示 DOP能夠通過對糖尿病肝組織的保護(hù)作用及增加肝組織肝糖原的合成來調(diào)節(jié)糖代謝

11、。
　　此外，從分子水平探討DOP調(diào)節(jié)糖代謝紊亂機(jī)制。采用Western blot法測定糖尿病小鼠肝組織中胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵蛋白IRS-β、IRS1，JNK、PI3K和Glut2的表達(dá)。結(jié)果顯示，DOP可以顯著抑制糖尿病小鼠肝組織內(nèi)JNK蛋白的表達(dá)，低（100mg/kg）、中（200mg/kg）、高（400mg/kg）劑量組 JNK蛋白表達(dá)抑制率分別為35.31%、68.77%、84.88%，呈顯著的劑量依賴關(guān)系。同時,DOP