EPI64C在病理性心肌肥厚中的作用、機(jī)制及轉(zhuǎn)化應(yīng)用研究.pdf

1、目的：
　　心力衰竭是各種終末期心臟疾病的最終歸宿，其發(fā)病率與病死率高，嚴(yán)重危害人類健康。在各種心血管疾病，如高血壓，心肌梗死和心臟瓣膜疾病等因素刺激下，心肌細(xì)胞會代償性肥大以適應(yīng)泵血的需要，然而心肌細(xì)胞病理性肥大所導(dǎo)致的心肌肥厚卻是心力衰竭發(fā)生發(fā)展最重要的獨立危險因素。由于心肌肥厚發(fā)病機(jī)制目前尚未充分探明，因而目前仍然缺乏有效治療靶點及治療藥物。近二十年來，鈣離子反應(yīng)性蛋白分子Calcineurin的過度激活被認(rèn)為是導(dǎo)致心肌細(xì)胞

2、肥大及心肌肥厚最為重要的細(xì)胞內(nèi)分子機(jī)制之一，然而關(guān)于其負(fù)調(diào)控機(jī)制卻研究甚少。EPI64C蛋白分子是在T細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)的一種Calcineurin與Ras信號通路雙重抑制蛋白，并且在T細(xì)胞增殖及活化中起著重要的負(fù)調(diào)控作用，然而關(guān)于其在心臟中的作用卻不清楚。本研究旨在闡明EPI64C在病理性心肌肥厚中的作用及其機(jī)制，并探索其在治療心肌肥厚疾病中的轉(zhuǎn)化應(yīng)用價值。
　　方法：
　　1.建立主動脈縮窄誘導(dǎo)的小鼠心肌肥厚模型，觀察EPI6

3、4C在壓力過負(fù)荷誘導(dǎo)的小鼠心肌肥厚過程中心肌表達(dá)水平的改變情況；收集擴(kuò)張型心肌病及肥厚型心肌病病人心臟移植術(shù)后的左室心肌樣本，并以正常心臟左室心肌樣本為對照，探明 EPI64C在心肌正常及病理狀態(tài)下的表達(dá)情況。
　　2.建立AngII刺激誘導(dǎo)新生大鼠心肌細(xì)胞肥大的體外模型，檢測EPI64C在肥大心肌細(xì)胞中的表達(dá)變化情況；使用慢病毒和腺病毒載體分別沉默和過表達(dá)EPI64C，觀察EPI64C功能增強(qiáng)或功能缺失對心肌細(xì)胞肥大的影響。

4、r>　　3.構(gòu)建心肌細(xì)胞特異性的Epi64c基因敲除小鼠，和心肌細(xì)胞特異性的Epi64c轉(zhuǎn)基因小鼠，檢驗EPI64C功能缺失和功能增強(qiáng)對小鼠壓力過負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚的作用。
　　4.構(gòu)建Ras抑制功能缺失的突變EPI64C轉(zhuǎn)基因小鼠，探尋EPI64C調(diào)控心肌肥厚是否通過抑制Ras活性發(fā)揮作用。
　　5.構(gòu)建Calcineurin結(jié)合功能缺失的截短EPI64C轉(zhuǎn)基因小鼠，解析EPI64C調(diào)控心肌肥厚是否通過抑制Calcineu

5、rin活性發(fā)揮作用，并闡明其具體作用機(jī)制。
　　6.構(gòu)建過表達(dá)EPI64C的慢病毒載體，體內(nèi)轉(zhuǎn)染食蟹猴心臟。建立猴主動脈縮窄誘導(dǎo)的心肌肥厚模型，探索過表達(dá)EPI64C的治療策略對猴心肌肥厚的治療和預(yù)防作用。
　　結(jié)果：
　　1.相比于正常心臟組織中較高的表達(dá)水平，EPI64C隨著小鼠心肌肥厚的發(fā)展逐漸下降，并且在人擴(kuò)張型心肌病及肥厚型心肌病左室心肌中表達(dá)量明顯下降。
　　2.體外敲低或過表達(dá)EPI64C表達(dá)水平可

6、以分別顯著加重或減輕Ang II誘導(dǎo)的新生大鼠心肌細(xì)胞肥大。
　　3.心肌細(xì)胞中Epi64c被敲除后，主動脈縮窄所誘導(dǎo)的心肌肥厚顯著加重；反之，EPI64C在心肌細(xì)胞中過表達(dá)可以抑制主動脈縮窄誘導(dǎo)的心肌肥厚。
　　4.EPI64C并不通過抑制Ras的活性發(fā)揮對心肌肥厚的負(fù)調(diào)控作用。
　　5.EPI64C抑制心肌肥厚的機(jī)制在于直接結(jié)合到Calcineurin的酶活性核心區(qū)域并抑制Calcineurin的活性，進(jìn)而抑制下游

7、NFAT轉(zhuǎn)錄活性。
　　6.猴心臟過表達(dá)EPI64C可以顯著抑制主動脈縮窄誘導(dǎo)的心肌肥厚。
　　結(jié)論：
　　EPI64C通過抑制Calcineurin-NFAT信號通路抑制壓力過負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚，是病理性心肌肥厚不可或缺的負(fù)調(diào)控蛋白，其表達(dá)水平降低與病理性心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。過表達(dá)EPI64C的基因治療策略在猴壓力過負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚中的成功治療應(yīng)用，提示EPI64C可以作為潛在的心肌肥厚治療靶標(biāo)，有重要的臨床轉(zhuǎn)