溶栓新藥瑞替普酶（Reteplase）變復性及分離純化的研究.pdf

1、瑞替普酶(Reteplase)是第三代溶血栓藥物，該產品在臨床上更具有藥物半衰期長、溶栓作用強、副作用小等優(yōu)點。Reteplase是組織型纖溶酶原激活劑的衍生體，在原分子結構的基礎上進行了功能域的刪除，保留了kringle II，蛋白酶兩個功能域及N端的3個氨基酸。該重組突變體是單鏈非糖基化蛋白，由355個氨基酸組成，分子量約為39kD，含有9對二硫鍵。 選用E.coli作為表達系統(tǒng)，目的蛋白能夠在很短時間內實現高水平表達，

2、但表達產物在胞內以無活性的聚集物一包涵體的形式存在。首先高密度發(fā)酵重組E.coli工程菌生產包涵體，其中IPTG的誘導是關鍵的一步。誘導條件的優(yōu)化既可以誘導蛋白最大限度的表達，又避免了過高的IPTG的濃度對工程菌的毒害作用。在IPTG的誘導下表達重組蛋白時，這些重組蛋白質會在細胞內凝集，形成無活性的包涵體顆粒。超聲裂解離心后得到的包涵體除含有目的蛋白外，還有一些核酸，雜蛋白和膜蛋白，包涵體的純度直接影響到后續(xù)變性與復性的效果，因此要獲得

3、純化的有活性的Reteplase，首先要提取和純化包涵體。低濃度的變性劑例如尿素可以除去包涵體上的一些膜蛋白等雜質，但是純化程度還是有一定的限制，應用鹽沈一尿素洗一水洗三次連續(xù)的洗滌純化方法能在相當程度上提高包涵體的純度，變性效果也有所提高。 變性的目的是將致密的包涵體打開，使沒有生物學活性的Reteplase轉為具有活性的蛋白質，以提高重組蛋白的復性率，降低生產成本。由于Reteplase分子中的l8個cys要形成9對

4、二硫鍵，所以利用E.coli表達Reteplase時，往往會發(fā)生二硫鍵的錯配，這也是包涵體形成的原因之一。所以溶解包涵體的時候要加入適當的變性液以打破所有的二硫鍵，不同的變性液對包涵體的溶解作用是不同的。經試驗比較，采用變性液(50 mmol/LTris，1mmol/L EDrrA，8 mol/L尿素，150 mmol/Lβ-巰基乙醇，pH 9.0)能使包涵體徹底溶解，有利于隨后的再折疊。影響重組蛋白復性的因素很多，根據Reteplas

5、e的特點，考慮了蛋白濃度，復性時間，復性溫度對復性效果的影響。我們采用稀釋復性法，實驗結果表明，最適的復性液是0.1 mol/LTris，1mmol/LEDTA，1 mmol/LGSH，0.2mmol/L GSS G,0.5 mol/L L-Arg，pH=10.5，尿素的終濃度為1.5mol/L。稀釋后在室溫下靜置24h。 采用ETI親和層析法對復性后的Reteplase進行純化，ETI是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑類，而Retepl