產(chǎn)核黃素枯草桿菌糖代謝途徑基因工程改造的初步研究.pdf

1、在過量合成核黃素的重組枯草芽孢桿菌中,糖分解代謝流在糖酵解途徑(EMP)和磷酸戊糖途徑(PP)的分配比例,影響細(xì)胞的核黃素合成速率、產(chǎn)量和得率.在枯草芽孢桿菌中,糖分解代謝通量在EMP途徑和PP途徑的分配比例大約為7比3；PP途徑的代謝通量受到細(xì)胞生長速率的調(diào)控,在一定范圍內(nèi)與細(xì)胞生長速率呈正比關(guān)系.由枯草芽孢桿菌遺傳特性所決定的糖分解代謝通量分布規(guī)律和調(diào)控方式,是進(jìn)一步提高核黃素合成速率和得率的主要限制因素.對核黃素生產(chǎn)菌株的糖代謝途

2、徑及調(diào)控方式進(jìn)行遺傳改造,提高PP途徑的代謝通量是進(jìn)一步提高重組枯草芽孢桿菌的核黃素發(fā)酵能力的關(guān)鍵. 本文利用基因工程方法,敲除了轉(zhuǎn)酮酶和CcpA蛋白缺陷型的核黃素發(fā)酵菌株B.subtilis24A1 6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶的編碼基因pgi,構(gòu)建了6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶缺陷菌株B.subtilis24B/pMX45.搖瓶發(fā)酵顯示,B.subtilis24B/pMX45不能利用葡萄糖作為唯一碳源生長,表明葡萄糖不能進(jìn)入EMP途徑,只能

3、經(jīng)PP途徑分解.在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入5﹪的果糖,能夠恢復(fù)B subtilis24B/pMX45的生長水平.在果糖和葡萄糖為混合碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基上,提高葡萄糖的濃度對于提高核黃素的產(chǎn)量幾乎沒有作用；隨著葡萄糖濃度提高,核黃素得率下降.實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明,敲除pgi基因,雖然使葡萄糖只能進(jìn)入PP途徑,但并不能使PP途徑的代謝通量隨著葡萄糖濃度的提高而增大,PP途徑的代謝通量受到其它的代謝調(diào)控機(jī)制的控制.在B.subtilis24B中,分別增加了PP