肉桂醛與腫瘤靶向性化合物ZT-6、8、9設(shè)計(jì)合成抗肺癌及機(jī)制研究.pdf

1、隨著人口的老齡化和環(huán)境的破壞，癌癥已經(jīng)成為了危害人類健康影響人類壽命的一種主要疾病之一。隨著環(huán)境惡化及工作壓力增加，癌癥的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)逐年遞增的趨勢。據(jù)國家中央癌癥登記中心的數(shù)據(jù)結(jié)果表明，2015年預(yù)計(jì)有429.2萬新發(fā)癌癥病例，其中281.4萬癌癥患者死亡，肺癌的死亡率高居榜首。目前，化學(xué)藥物治療仍是治療肺癌的主要手段之一，但其毒副作用大、腫瘤耐藥性的缺點(diǎn)，使得患者3年生存率大大降低，生活和生存質(zhì)量下降。針對這一個(gè)現(xiàn)狀，尋找一種

2、抗腫瘤效果好、毒副作用低的天然化合物，設(shè)計(jì)合成具有腫瘤靶向性的化合物更成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。
　　中醫(yī)藥為我國的寶庫，在與疾病做斗爭的過程中，基于人體治療和預(yù)防疾病的臨床有效驗(yàn)方成為新藥篩選研發(fā)的寶貴線索。本課題在前期文獻(xiàn)檢索、專利查詢等發(fā)現(xiàn)肉桂的揮發(fā)油具有抗腫瘤作用，而肉桂醛是其中含量較高的單體化合物之一，通過分析其官能團(tuán)-“醛”結(jié)構(gòu)，根據(jù)醛的理化性質(zhì)分析其具有抗氧化和氧化的“雙重”作用，基于其構(gòu)-效關(guān)系，本課題擬對其抗肺癌作用

3、及其機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)的研究。
　　同時(shí)，ZT系列化合物是本課題組設(shè)計(jì)合成的一類以氨基酸為靶向載體的新型靶向性抗腫瘤藥物，其中分別以谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸為癌組織靶向性分布載體，設(shè)計(jì)合成了ZT-3、ZT-18、ZT-21化合物，經(jīng)過接種人肺癌荷瘤動(dòng)物驗(yàn)證其均有不同腫瘤選擇性的抗腫瘤作用。本課題也將利用腫瘤組織對不同氨基酸的選擇性吸收和分布，對同樣具有在肺癌組織中具有靶向性分布的天冬氨酸、瓜氨酸、天冬酰胺進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，設(shè)計(jì)合成ZT-6、

4、ZT-8、ZT-9化合物。
　　本論文主要分為三章：
　　第一章對肉桂醛中藥單體體外抗肺癌藥效學(xué)進(jìn)行研究，第二章系統(tǒng)地闡述肉桂醛對肺癌的分子靶標(biāo)及其潛在的作用機(jī)制；第三章擬用天冬氨酸、天冬酰胺、瓜氨酸為靶向載體，與草酰氯單乙酯進(jìn)行縮合藕連成三羧酸循環(huán)中關(guān)鍵代謝物質(zhì)草酰乙酸的類似物 ZT-6、8、9，通過改進(jìn)合成工藝，摸索最佳反應(yīng)條件，提高純度至95％以上，獲得不易吸潮的固體粉末，為成藥性評價(jià)奠定基礎(chǔ)。
　　第一章肉桂醛

5、體外抗肺癌藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)研究
　　采用MTT法檢測肉桂醛對非小細(xì)胞肺癌SPC-A1細(xì)胞的增殖影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度的肉桂醛（0、25、50、100、200μM·L-1）對肺癌SPC-A1處理后，其增殖情況都受到不同程度的抑制作用，其影響呈現(xiàn)濃度和時(shí)間依賴性。通過SPSS VII數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，體外給予肉桂醛24、48、72hrs后，其抗SPC-A1增殖的半數(shù)抑制濃度IC50分別為135.7、41.70和31.71μM·L-1。說明肉桂

6、醛在體外抑制非小細(xì)胞肺癌SPC-A1細(xì)胞的增殖呈現(xiàn)出較好的時(shí)間依賴性。
　　第二章肉桂醛體外抗肺癌機(jī)制研究
　　第一節(jié)肉桂醛誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)
　?。?）采用Hoechst33258熒光染色觀察肉桂醛對非小細(xì)胞肺癌SPC-A1細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度的肉桂醛（0、25、50、100、200μM·L-1）對肺癌SPC-A1細(xì)胞處理后，置熒光顯微鏡下觀察可見肺癌細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞核固縮，濃染而呈亮藍(lán)色，出

7、現(xiàn)凋亡小體，其數(shù)量與肉桂醛作用濃度正相關(guān)。說明肉桂醛能引起肺癌SPC-A1細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)的變化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　?。?）采用流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合FITC-AnnexinV/PI雙標(biāo)記染色法檢測肉桂醛對非小細(xì)胞肺癌 SPC-A1細(xì)胞的凋亡情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度的肉桂醛（0、25、50、100、200μM·L-1）作用SPC-A1細(xì)胞24 h后的總凋亡率分別0.93%，11.5%，26.9%，46.3%，64.4%，呈濃度依賴性。并

8、且，數(shù)值與 MTT法檢測所得的抑制率基本一致，說明肉桂醛影響SPC-A1細(xì)胞的增殖與誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡有關(guān)。
　　第二節(jié)肉桂醛對肺癌細(xì)胞周期的影響
　　采用流式細(xì)胞術(shù)檢測肉桂醛對非小細(xì)胞肺癌SPC-A1細(xì)胞的周期影響。通過PI染色，觀察到對照組是典型的腫瘤細(xì)胞增殖周期的峰形，而在肉桂醛作用SPC-A1細(xì)胞12 h后，細(xì)胞周期的各個(gè)時(shí)期均發(fā)生了顯著的變化，隨著肉桂醛濃度的升高，細(xì)胞 S期比例隨著肉桂醛濃度升高，表現(xiàn)出一定的濃度依

9、賴性，但G0/G1期與G2/M期沒有表現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，肉桂醛有可能通過阻滯SPC-A1細(xì)胞周期的S期，影響有絲分裂的進(jìn)行從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　第三節(jié)肉桂醛對肺癌細(xì)胞線粒體膜電位的影響
　　采用流式細(xì)胞術(shù)通過JC-1熒光探針檢測肉桂醛對非小細(xì)胞肺癌SPC-A1的線粒體膜電位（MMP）的影響。在肉桂醛處理SPC-A112 h后，不同濃度的實(shí)驗(yàn)組相對于對照組均表現(xiàn)出了線粒體膜電位的下降現(xiàn)象，且隨著肉桂醛濃度的

10、不斷增加，膜電位下降的細(xì)胞比例變大，呈現(xiàn)濃度依賴性。MMP下降說明肉桂醛誘導(dǎo)的凋亡屬于線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑。
　　第四節(jié)肉桂醛對細(xì)胞活性氧的影響
　　采用流式細(xì)胞術(shù)通過 DCFH-DA熒光探針檢測肉桂醛對非小細(xì)胞肺癌SPC-A1胞內(nèi)活性氧水平的影響。結(jié)果顯示，與對照組進(jìn)行對比不同濃度的肉桂醛處理SPC-A1細(xì)胞12 h后，低濃度的肉桂醛即能提高活性氧ROS的水平，但高濃度的肉桂醛升高活性氧的水平更加顯著，呈現(xiàn)出很明顯的濃度依

11、賴性。說明肉桂醛有可能通過擾亂細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，尤其是提高ROS水平來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。
　　第五節(jié)肉桂醛對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞Bax和Bcl-2凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。
　　利用Western Blot檢測分析Bax和Bcl-2凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度的肉桂醛孵育SPC-A1細(xì)胞24 h后，促凋亡蛋白Bax隨著肉桂醛的濃度，表達(dá)量也隨之增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)量則呈現(xiàn)下降趨勢，肉桂醛誘導(dǎo)惡性腫瘤細(xì)

12、胞的凋亡指數(shù)Bax/Bcl-2呈現(xiàn)出劑量依賴性。
　　第六節(jié)肉桂醛對Trx抗氧化系統(tǒng)Trx和TrxR蛋白表達(dá)的影響
　　利用Western Blot檢測肉桂醛介導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌SPC-A1細(xì)胞Trx抗氧化系統(tǒng)Trx和TrxR蛋白表達(dá)水平。肉桂醛作用于SPC-A1細(xì)胞后，胞內(nèi)的硫氧還蛋白Trx和硫氧還蛋白還原酶TrxR的表達(dá)水平呈現(xiàn)劑量依賴性上升，該結(jié)果證明了肉桂醛能激活Trx系統(tǒng)，從而導(dǎo)致胞內(nèi)活性氧的積累，啟動(dòng)凋亡程序。

13、>　　第三章基于腫瘤靶向性分布的氨基酸為載體的藥物 ZT-6、8、9的設(shè)計(jì)合成
　　基于氨基酸為腫瘤組織靶向性分布的載體，分別以天冬氨酸二叔丁基鹽酸鹽、瓜氨酸叔丁基鹽酸鹽、天冬酰胺叔丁基鹽酸鹽與草酰氯單乙酯為原料，采用液相合成法，發(fā)生?；詈?，酸性環(huán)境下脫去叔丁基保護(hù)基團(tuán)，設(shè)計(jì)合成具有腫瘤靶向性的化合物 ZT-6、8、9。經(jīng)高效液相色譜、氫譜、碳譜和質(zhì)譜等技術(shù)確認(rèn)其分子量及化學(xué)結(jié)構(gòu)，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)與原設(shè)計(jì)目標(biāo)化合物相吻合。
　

14、　綜上所述，本研究的結(jié)果顯示，肉桂醛可以抑制肺癌細(xì)胞SPC-A-1的增值，而且其抗癌作用與通過線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑，通過阻滯細(xì)胞周期的S期影響腫瘤細(xì)胞的有絲分裂，激活抗氧化系統(tǒng)Trx系統(tǒng)引起胞內(nèi)活性氧ROS水平的積累，隨后激活促凋亡基因Bax和抑制抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，發(fā)揮綜合作用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究系統(tǒng)地研究了肉桂醛的抗癌作用，并闡明了其部分作用機(jī)制，為進(jìn)一步評估肉桂醛的成藥性開發(fā)新藥奠定了基礎(chǔ)。
　　另外，本研究設(shè)計(jì)了并