斑馬魚Cyp19A2基因5′-調(diào)控序列的分析研究和Cyp2J1基因的表達(dá)及初步功能研究.pdf

1、斑馬魚中存在兩個(gè)細(xì)胞色素P450芳香酶基因，即Cypl9A1和Cyp19A2，分別在生殖腺和腦部特異表達(dá)，其編碼產(chǎn)物P450芳香酶能夠參與魚體內(nèi)的雌激素合成，催化雄激素轉(zhuǎn)變?yōu)榇萍に?，因此在斑馬魚性激素分泌和性器官發(fā)育過程中都起到非常重要的調(diào)節(jié)作用。目前關(guān)于兩個(gè)芳香酶基因的特異表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究報(bào)道極少，僅限于生物信息學(xué)方面的分析。在本論文中，我們克隆了斑馬魚Cypl9A2基因的5'調(diào)控序列，并初步進(jìn)行了功能分析。通過一系列的內(nèi)部引物，擴(kuò)

2、增出不同長(zhǎng)度的調(diào)控區(qū)域，分別構(gòu)建至報(bào)告基因表達(dá)載體，包括：pEGFP-aF-aR(-2600～-1bp)、pEGFP-cF-aR(-1700～-1bp)、pEGFP-bF-dR(-2200～-700bp)、pEGFP-cF-dR(-1700～-700bp)、pEGFP-aF-CR(-2600～-1700bp)、pEGFP-aF-bR(-2600～-2200bp)和pEGFP-dF-aR(-700～-1bp)等7個(gè)載體，分別顯微注射至斑馬

3、魚1～2細(xì)胞期的受精卵，追蹤觀察報(bào)告基因的時(shí)空表達(dá)情況，分析調(diào)控區(qū)的功能。結(jié)果顯示：注射pEGFP-aF-aR的胚胎，當(dāng)發(fā)育至48hpf，其腦部，包括間腦和中腦部位，以及由腦部向軀干延伸的部分神經(jīng)細(xì)胞和表層細(xì)胞有EGFP特異表達(dá)；注射pEGFP-cF-aR和pEGFP-dF-aR的胚胎，從24hpf開始，EGFP始終集中在卵黃囊表層細(xì)胞表達(dá)，未出現(xiàn)腦部特異表達(dá)；其余4個(gè)表達(dá)載體的注射胚胎均沒有檢測(cè)到EGFP的表達(dá)。提示：1)斑馬魚Cyp

4、l9／12基因上游-2600bp調(diào)控序列全長(zhǎng)與組織特異表達(dá)密切相關(guān)；2)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-1700bp和-700bp是該基因的啟動(dòng)活性區(qū)域，能驅(qū)動(dòng)EGFP基因的非特異表達(dá)，-700bp是啟動(dòng)表達(dá)所需的最短序列；3)與Cypl9A2基因特異表達(dá)相關(guān)的調(diào)控元件極有可能位于-2600～-1700bp區(qū)域內(nèi)。 細(xì)胞色素P4502J(Cyp2J)是P450超家族中的一個(gè)亞家族，該亞家族目前已發(fā)現(xiàn)有9個(gè)基因，即Cyp2J1～CypZl9，其

5、編碼的蛋白酶能夠催化大多數(shù)哺乳動(dòng)物體內(nèi)的花生四烯酸代謝反應(yīng)，在許多外源及內(nèi)源的固醇類物質(zhì)氧化還原反應(yīng)中起重要作用。然而在斑馬魚中，至今未見有關(guān)于該亞家族基因表達(dá)及功能研究的報(bào)道。本文中，我們克隆了斑馬魚的CypZll基因，進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，檢測(cè)了斑馬魚胚胎及成體組織中CypZll的表達(dá)情況，同時(shí)進(jìn)行了CypZll的過表達(dá)研究。結(jié)果如下：1)斑馬魚CypZll基因全長(zhǎng)1600bp，編碼496個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。BLAST分析表明，斑馬魚

6、的Cyp2J1與小鼠Cyp2J6(NM010008)，人Cyp2J2(NM000775)，BostaurusCypZl2(XP589364)和大鼠Cyp2J4(AAF21133)分別具有51﹪、50﹪、51﹪和50﹪的序列同源性。斑馬魚CypZll含有與人Cyp2J2和小鼠Cyp2J6極其相似的保守結(jié)構(gòu)域，暗示它們可能具有類似的生物催化活性；2)原位雜交結(jié)果顯示zfCyp2J1主要集中在成魚的腦，包括端腦外圍區(qū)、腹面間腦區(qū)和下丘腦區(qū)以及

7、生殖腺，包括卵巢中處于I期和II期發(fā)育階段的卵黃顆粒沉積前卵母細(xì)胞和精巢中靠近精小葉邊緣的部分精原細(xì)胞中表達(dá)，但在斑馬魚早期胚胎中沒有檢測(cè)到zfCyp2J1的原位雜交信號(hào)；3)半定量RT-PCR結(jié)果顯示zfCyp2J1的mRNA在斑馬魚多種組織中廣泛分布，如大腦和生殖腺，以及心臟、肝臟、。腎臟和肌肉等組織，同時(shí)36hpf的斑馬魚胚胎中也能檢測(cè)到zfCyp2J1的mRNA；4)斑馬魚Cyp2J1的過表達(dá)能嚴(yán)重影響胚胎的正常發(fā)育，造成胚胎近