木瓜蛋白酶的化學(xué)修飾及固定化研究.pdf

1、酶的化學(xué)修飾能夠改進(jìn)酶的物理化學(xué)性能、提高其生物活性，已受到越來(lái)越多的重視。其主要方法包括交聯(lián)技術(shù)，定點(diǎn)突變和化學(xué)修飾結(jié)合技術(shù)、小分子修飾、單功能聚合物化學(xué)修飾等。酶的固定化處理能夠進(jìn)一步提高其穩(wěn)定性。
　　 木瓜蛋白酶(EC3.4.22.2)作為水解蛋白酶屬于半胱氨酸蛋白酶家族，主要存在于番木瓜的乳汁中，其應(yīng)用廣泛，包括細(xì)胞分離、化妝品、洗滌劑、食品和醫(yī)藥等行業(yè)，由于受到環(huán)境和其他條件的影響，容易變性失活，降低催化效率，從而限

2、制了其大規(guī)模的應(yīng)用。
　　 本論文首次以三種新型的酸酐修飾劑在底物保護(hù)和無(wú)底物保護(hù)下對(duì)木瓜蛋白酶進(jìn)行化學(xué)修飾，以三硝基苯磺酸法測(cè)定修飾酶的平均氨基修飾率，對(duì)修飾前后的木瓜蛋白酶分別純化并通過(guò)UV-vis和IR對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。考察了溫度、pH值、表面活性劑SDS和金屬離子對(duì)化學(xué)修飾酶活力的影響，并與天然木瓜蛋白酶進(jìn)行了比較，對(duì)天然酶和修飾酶進(jìn)行了動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)研究。結(jié)果表明，化學(xué)修飾酶的最適反應(yīng)溫度為80℃;最適pH值為9.0

3、;在SDS濃度為5mg/mL時(shí)修飾酶酶活仍能保持在50％左右；在所有酶中，均苯四甲酸酐修飾酶的催化效率最高，為2.442×102，△H*，△G*和△S*分別為131.8kJ/mol，80.17kJ/mol和151.9J/mol·K，顯示了化學(xué)修飾提高了木瓜蛋白酶的穩(wěn)定性。與天然酶相比，化學(xué)修飾酶的熱穩(wěn)定性、耐堿性和耐洗滌性得到了明顯提高。
　　 本論文通過(guò)合成方法制備了兩種不同分子量的單甲氧基聚乙二醇(mPEG)衍生物，對(duì)木瓜蛋

4、白酶進(jìn)行了修飾，對(duì)修飾酶的熱穩(wěn)定性、耐酸堿性、在有機(jī)溶劑中的穩(wěn)定性和動(dòng)力學(xué)等相關(guān)參數(shù)進(jìn)行了測(cè)定并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了一系列表征。結(jié)果表明，木瓜蛋白酶經(jīng)過(guò)不同分子量的修飾劑修飾后，其活性均得到了很好的保留；熱穩(wěn)定性測(cè)定顯著提高，且熱穩(wěn)定性與修飾劑分子量有關(guān)；修飾酶Km值的測(cè)定表明在活潑位點(diǎn)不被修飾、整體結(jié)構(gòu)不發(fā)生較大改變的情況下可以保持較高的對(duì)底物的表觀親和力。隨著修飾劑分子量的增大，修飾酶的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳速度減慢。
　　 另

5、外，本論文將化學(xué)修飾酶進(jìn)行了固定化處理，先對(duì)棉布進(jìn)行活化，以活化后的棉布為載體，戊二醛為交聯(lián)劑，對(duì)修飾前后的木瓜蛋白酶分別進(jìn)行固定化，考察了固定化酶性質(zhì)，對(duì)固定化酶棉織物的貯存穩(wěn)定性、回潮率和透氣性能進(jìn)行了測(cè)定，并首次探討了木瓜蛋白酶對(duì)酪氨酸的抑制作用。結(jié)果表明，棉布經(jīng)過(guò)活化以后，在溫和條件下實(shí)現(xiàn)木瓜蛋白酶固定化，固定化酶的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性有了明顯的提高。在不加任何保護(hù)劑的條件下，在室溫條件下放置30d后游離酶僅保持一半的酶活，固定