二次諧波和雙光子激發(fā)熒光(SHG-TPEF)顯微成像技術(shù)診斷腎臟纖維化的系統(tǒng)研究.pdf

1、本研究擬建立移植腎慢性排斥模型、移植腎急性排斥模型、環(huán)孢素腎病模型、單側(cè)輸尿管梗阻模型這4種不同病因的大鼠腎纖維化模型，并使用非線性光學(xué)顯微鏡掃描標(biāo)本并觀察膠原纖維的動態(tài)變化，為今后建立計算機(jī)軟件輔助的腎纖維化精確診斷和分級系統(tǒng)提供原始的膠原蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)參數(shù)。
　　第一部分SHG/TPEF顯微成像技術(shù)診斷人移植腎纖維化的研究
　　目的:評估SHG/TPEF顯微成像技術(shù)用于診斷人移植腎間質(zhì)纖維化的可行性;比較SHG/TPEF顯

2、微成像技術(shù)與傳統(tǒng)病理染色相比對腎臟早期纖維化評估的敏感性;驗(yàn)證SHG/TPEF顯微成像技術(shù)在不同時間或不同觀察者之間的可重復(fù)性;比較SHG/TPEF顯微成像技術(shù)與Masson染色技術(shù)評估人移植腎皮質(zhì)纖維化比例的差異;將Masson染色圖片和SHG/TPEF圖片測算出來的皮質(zhì)纖維化比例根據(jù)Banff07標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級評分，比較分級的一致性，評價SHG/TPEF成像用于評估人移植腎間質(zhì)纖維化可靠性。
　　方法:2011年1月至2013年

3、3月間我院共行143例移植腎活檢術(shù)。按隨機(jī)原則從中抽樣50例石蠟樣本，其中8例診斷為不合格標(biāo)本，共有42例標(biāo)本納入研究。按照傳統(tǒng)病理診斷將標(biāo)本分為2組:輕度纖維化組24例，中重度纖維化組18例。將入選的石蠟標(biāo)本連續(xù)2張切片，每張5μm，第1張切片行HE染色，第2張切片無需特殊染色，直接使用SHG/TPEF設(shè)備將白片掃描成像后，再將該標(biāo)本行Masson染色。使用SHG/TPEF顯微鏡掃描切片，評估該技術(shù)用于觀察人腎臟皮質(zhì)內(nèi)膠原纖維的可行性

4、。使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用信度分析檢驗(yàn)SHG/TPEF技術(shù)在同一時間不同觀察者之間的可重復(fù)性，采用可重復(fù)測量的方差分析檢驗(yàn)SHG/TPEF技術(shù)在不同時間點(diǎn)同一觀察者的可重復(fù)性。將輕度纖維化組中標(biāo)本的SHG/TPEF圖像與Masson染色圖像進(jìn)行對比，驗(yàn)證SHG/TPEF成像評估早期腎纖維化的敏感性。在獲得42例標(biāo)本的Masson染色及SHG/TPEF圖像后，使用Image-Pro-

5、Plus(6.0版)軟件計算兩組圖像的皮質(zhì)纖維化比例，采用配對樣本t檢驗(yàn)驗(yàn)證Masson染色和SHG/TPEF兩種方法算出的皮質(zhì)纖維化比例之間的差異，以P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。以上述2種方法測算出的皮質(zhì)纖維化比例為依據(jù)，根據(jù)Banff07標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級評分，采用Kappa檢驗(yàn)比較纖維化分級評分的一致性，當(dāng)kappa值>0.75代表一致性好，0.40≤ kappa值≤0.75代表一致性較好，kappa值<0.4代表一致性差。
　　

6、結(jié)果:人移植腎標(biāo)本經(jīng)非線性光學(xué)顯微鏡掃描后，可獲得清晰的TPEF和SHG圖像，證實(shí)了人移植腎臟組織存在非線性光學(xué)現(xiàn)象?？芍貜?fù)測量的方差分析顯示:同一觀察者、不同時間點(diǎn)的SHG/TPEF圖像的皮質(zhì)纖維化比例無統(tǒng)計學(xué)差異（F=6.545，P=0.063）;信度分析顯示:同一時間、不同觀察者之間的SHG/TPEF圖像皮質(zhì)纖維化比例的信度有高度一致性(ICC=0.998，P<0.001)，表明SHG/TPEF技術(shù)在不同觀察者之間、不同時間可重復(fù)

7、性高。對比輕度纖維化組標(biāo)本的Masson染色和SHG/TPEF圖像，發(fā)現(xiàn)病變早期時肉眼未能發(fā)現(xiàn)Masson圖像中的膠原纖維，而在SHG/TPEF圖像中可清晰分辨出膠原纖維，證明SHG/TPEF成像靈敏度高于Masson染色。采用配對樣本t檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)使用SHG/TPEF及Masson染色兩種方法評估皮質(zhì)纖維化比例無統(tǒng)計學(xué)差異(t=-1.703，P=0.096)，表明SHG/TPEF纖維化比例與Masson纖維化比例一致性良好。用Kappa檢

8、驗(yàn)比較基于上述兩種纖維化比例的Banff分級是否一致，發(fā)現(xiàn)其kappa值為0.845（P<0.001），表明基于SHG的纖維化比例和Masson纖維化比例進(jìn)行的Banf分級一致性好。
　　結(jié)論:SHG/TPEF顯微成像技術(shù)用于觀察人移植腎纖維化具有可行性;與Masson染色技術(shù)比較，SHG/TPEF顯微鏡對腎臟早期膠原纖維的分辨更敏感;使用SHG/TPEF評估腎皮質(zhì)纖維化比例與Masson染色相比無顯著差異;基于SHGSHG/TP

9、EF進(jìn)行的Banff纖維化分級評分與Masson染色分級評分相比一致性好;SHG/TPEF顯微成像技術(shù)可重復(fù)性高，受時間及觀察者之間的差異影響小，對膠原纖維特異性高，是一種很有潛力的診斷腎間質(zhì)纖維化的新技術(shù)。
　　第二部分4種大鼠腎臟纖維化模型的建立以及用SHG/TPEF技術(shù)觀察
　　大鼠腎臟膠原纖維的研究
　　目的:建立大鼠腎移植慢性排斥模型、大鼠腎移植急性排斥模型、大鼠環(huán)孢素腎病模型、大鼠UUO模型這4種不同病因的

10、大鼠腎臟纖維化模型，并使用SHG/TPEF顯微成像技術(shù)對不同模型中不同時段的大鼠腎臟標(biāo)本進(jìn)行掃描，觀察膠原纖維在不同病因模型中的類型、發(fā)生、發(fā)展及分布情況。
　　方法:建立大鼠腎移植慢性排斥模型，以2只SD大鼠為正常對照組，分別取雙腎作為對照，以12只Wista大鼠為供者，取其雙側(cè)腎臟，以24只SD大鼠為受者，將供者左、右側(cè)供腎分別隨機(jī)移植給24只SD大鼠（慢排組），術(shù)后持續(xù)給予腎移植大鼠環(huán)孢素A注射液(2mg/kg.d-1)腹腔

11、注射，隨機(jī)于腎移植術(shù)后2周（2W組）、4周（4W組）、6周（6W組）、8周(8W組)、10周（10W組）、12周（12W組）每次處死4只大鼠(n=4)，獲取大鼠的移植腎，比較慢排組與對照組的腎臟組織病理學(xué)改變，驗(yàn)證慢性排斥模型是否建模成功，使用單因素方差分析比較慢性排斥組中各組的皮質(zhì)纖維化比例是否存在差異，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。建立大鼠腎移植急性排斥模型，隨機(jī)將16只Wistar大鼠的左腎移植給16只SD大鼠（原位移植），

12、術(shù)后將16只腎移植大鼠分成A、B兩組，A組為急性排斥組，術(shù)后未予免疫抑制劑，B組為對照組，術(shù)后給予環(huán)孢素A注射液(2 mg/kg.d-l)腹腔注射。隨機(jī)于腎移植術(shù)后第1天（1d組）、3天(3d組)、5天（5d組）、7天（7d組）將A和B組大鼠每次每組挑選出2只大鼠處死，取出移植腎，比較急性排斥組與對照組的腎臟組織病理學(xué)改變，驗(yàn)證急性排斥模型是否建模成功，并使用單因素方差分析比較急性排斥組中各組的皮質(zhì)纖維化比例是否存在差異，以P＜0.05

13、表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。建立大鼠環(huán)孢素腎病模型，25只SD大鼠予以低鈉飲食飼養(yǎng)1周，隨機(jī)選擇5只大鼠處死取左腎（對照組），剩余20只大鼠予以環(huán)孢素A(30 mg/kg.d-1)腹腔內(nèi)注射，并繼續(xù)予以低鈉飲食，按隨機(jī)原則將20只大鼠分為4組，每組5只，分別在給藥后1周(1w組)、2周（2W組）、4周(4W組)、6周（6W組）取大鼠左腎，比較環(huán)孢素腎病組與對照組的腎臟組織病理學(xué)改變，驗(yàn)證環(huán)孢素腎病模型是否建模成功，并使用單因素方差分析比較環(huán)孢

14、素中毒組中各組的皮質(zhì)纖維化比例是否存在差異，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。建立大鼠單側(cè)輸尿管梗阻模型，18只SD大鼠按隨機(jī)原則分為UUO組和假手術(shù)組(sham)，每組9只，手術(shù)組結(jié)扎左側(cè)輸尿管，假手術(shù)組僅分離輸尿管，不結(jié)扎。分別于建模后第3天（3d組）、7天(7d組)、14天（14d組）時取兩組大鼠左側(cè)腎臟，比較UUO組與sham組的腎臟組織病理學(xué)改變，驗(yàn)證UUO模型是否建模成功，并使用用單因素方差分析比較UUO模型中各組的皮質(zhì)纖

15、維化比例是否存在差異，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。通過SHG/TPEF掃描4種模型各時段的腎臟標(biāo)本，動態(tài)觀察不同病因引起的腎臟膠原纖維的類型、發(fā)生、發(fā)展過程及形態(tài)、分布特點(diǎn)。
　　結(jié)果:傳統(tǒng)病理證實(shí)4種不同病因的大鼠腎纖維化模型建模成功，單因素方差分析顯示慢性排斥組（F=104.53，P=0.000）、環(huán)孢素腎病組(F=76.191，P=0.000)、UUO組(F=27.23，P=0.001)中各時間段的皮質(zhì)纖維化比例有統(tǒng)

16、計學(xué)差異，而急性排斥組中各時段的皮質(zhì)纖維化比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=4.722，P=0.084)。UUO模型的腎臟纖維化進(jìn)展最為迅速，術(shù)后第7天腎間質(zhì)即可觀察到膠原纖維廣泛形成，而術(shù)后第14天可以觀察到移植腎間質(zhì)重度纖維化。腎移植急性排斥模型，腎間質(zhì)未出現(xiàn)進(jìn)展性纖維化。移植腎慢性排斥模型建模周期長，纖維化進(jìn)展較慢。而低鈉飲食大鼠的環(huán)孢素A腎病模型在6周內(nèi)即可觀察到腎間質(zhì)中大量膠原分布。使用SHG/TPEF和傳統(tǒng)病理技術(shù)對4種模型腎臟進(jìn)行

17、觀察發(fā)現(xiàn)，Masson染色圖片中鮑曼氏囊囊壁及腎小球基底膜有藍(lán)染的膠原纖維，但在SHG/TPEF圖像中，鮑曼氏囊囊壁及腎小球基底膜未見綠色的膠原信號。膠原纖維大部分沉積在皮質(zhì)區(qū)的腎間質(zhì)中以及皮髓交界處，在髓質(zhì)區(qū)基本無膠原纖維分布;腎臟中膠原纖維的形成、發(fā)展、沉積在3種不同病因的腎臟模型中過程類似，僅纖維形成的時間進(jìn)程根據(jù)病因的不同有快慢。
　　結(jié)論:4種大鼠腎纖維化模型建模成功，大鼠UUO、CsA中毒、慢排模型腎間質(zhì)纖維化明顯，急