一株鞘氨醇桿菌合成類胡蘿卜素的分子機(jī)制和代謝雜環(huán)的氧化壓力研究.pdf

1、利用微生物技術(shù)去除環(huán)境中的有害物質(zhì)是最為經(jīng)濟(jì)可行的環(huán)境修復(fù)方法。微生物對(duì)環(huán)境有機(jī)污染物的降解主要涉及氧化反應(yīng)，而有O2參與的氧化反應(yīng)往往會(huì)產(chǎn)生能夠損傷DNA、蛋白質(zhì)和其他細(xì)胞組分的活性氧自由基(ROS)，影響細(xì)胞存活，從而降低微生物對(duì)環(huán)境有機(jī)污染物的降解能力和速率。類胡蘿卜素作為一種膜結(jié)合的抗氧化劑能夠保護(hù)細(xì)胞抵御氧化壓力。
　　 本文在課題組前期對(duì)一株咔唑降解菌——鞘氨醇桿菌XLDN2-5（Sphingobium yanoik

2、uyae XLDN2-5）進(jìn)行全基因組測(cè)序和注釋的基礎(chǔ)上，分析預(yù)測(cè)了6個(gè)ORFs涉及類胡蘿卜素合成途徑，它們分別編碼牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶(GGPP synthase，CrtE)、八氫番茄紅素合成酶（phytoene synthase，CrtB）、八氫番茄紅素脫氫酶(phytoene dehydrogenase，CrtI)、番茄紅素環(huán)化酶(lycopene cyclase，CrtY)、β-胡蘿卜素羥化酶（β-carotene hy

3、droxygenase，CrtZ）和酮酶(β-carotene ketolase，CrtW)，將此6個(gè)ORF分別命名為crtE、crtB、crtI、crtY、 crtZ和crtW。通過(guò)序列比對(duì)可知，這些基因與已報(bào)道的類胡蘿卜素合成相關(guān)基因有30-60％的相似性。但與已報(bào)道的大多數(shù)微生物體內(nèi)類胡蘿卜素合成基因的成簇排布方式不同，在鞘氨醇桿菌XLDN2-5中，除了crtY基因的終止密碼子與crtI基因的起始密碼子重疊并與crtB基因鄰近外，

4、其他類胡蘿卜素合成基因散布在基因組的其他位置。
　　 隨后，利用PCR擴(kuò)增類胡蘿卜素合成相關(guān)基因，構(gòu)建相應(yīng)質(zhì)粒，通過(guò)雙質(zhì)粒共表達(dá)的方法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入能夠積累不同類胡蘿卜素中間產(chǎn)物的Escherichia coli中，HPLC、HPLC-MS分析產(chǎn)物，從而驗(yàn)證基因功能。結(jié)果表明，crtI基因編碼八氫番茄紅素脫氫酶，催化八氫番茄紅素(phytoene)脫氫生成番茄紅素(lycopene); crtY基因編碼番茄紅素環(huán)化酶，在番茄紅素的兩

5、端環(huán)化形成β-胡蘿卜素(β-carotene);crtZ基因編碼β-胡蘿卜素羥化酶，依次在β-胡蘿卜素兩端環(huán)上加一個(gè)羥基，經(jīng)僅在一個(gè)環(huán)上含有羥基的中間體β-cryptoxanthin，生成玉米黃質(zhì)（zeaxanthin）;而crtE和crtB基因共同表達(dá)時(shí)卻未檢測(cè)到預(yù)期的產(chǎn)物——八氫番茄紅素，crtW基因也未顯示出β-胡蘿卜素酮酶的功能活性，不能將玉米黃質(zhì)催化生成蝦青素（astaxanthin）。
　　 HPLC-MS分析來(lái)自鞘

6、氨醇桿菌XLDN2-5菌體的丙酮抽提物，可確定該菌主要積累玉米黃質(zhì)。當(dāng)共代謝咔唑(CA)和二苯并噻吩(DBT)時(shí)，菌體顏色從降解CA時(shí)的淺黃色變?yōu)樯铧S色，共代謝CA和苯并噻吩(BT)時(shí)的菌體顏色次之;菌體中積累的玉米黃質(zhì)含量隨菌體對(duì)不同雜環(huán)化合物的降解而有極顯著的提高(CA＜CA+BT＜CA+DBT)。
　　 在鞘氨醇桿菌XLDN2-5降解CA、轉(zhuǎn)化BT和DBT的過(guò)程中，尤其是在共代謝CA和DBT時(shí)，利用氧化壓力敏感性探針DCF

7、H-DA檢測(cè)到菌體內(nèi)產(chǎn)生了大量的H2O2，菌體受到的氧化壓力遠(yuǎn)高于葡萄糖培養(yǎng)的對(duì)照組;在持續(xù)降解雜環(huán)化合物的生長(zhǎng)體系中，單位體積培養(yǎng)液內(nèi)的菌體量隨細(xì)胞氧化壓力的增加(G＜ CA＜BT＜DBT)而逐漸減少(G＞CA＞BT＞DBT)，多次添加雜環(huán)底物后，菌株XLDN2-5對(duì)雜環(huán)化合物的降解能力明顯減弱。同時(shí)，類胡蘿卜素合成關(guān)鍵酶——八氫番茄紅素脫氫酶基因(crtI)的表達(dá)水平隨著菌株對(duì)不同雜環(huán)化合物的降解而增加，且隨培養(yǎng)基內(nèi)DBT濃度的提高

8、而增加。相反，β-胡蘿卜素羥化酶基因(crtZ)的表達(dá)水平隨著菌株對(duì)不同種類或不同濃度的雜環(huán)化合物的降解而有明顯降低，且不隨菌體積累玉米黃質(zhì)含量的變化而變化。八氫番茄紅素脫氫酶(CrtI)的高表達(dá)能夠保證玉米黃質(zhì)前體——β-胡蘿卜素的積累。盡管β-胡蘿卜素羥化酶(CrtZ)表達(dá)水平降低，但最終會(huì)因其反應(yīng)前體β-胡蘿卜素的增加而提高菌體內(nèi)玉米黃質(zhì)的含量。
　　 總之，在降解雜環(huán)化合物的過(guò)程中，鞘氨醇桿菌XLDN2-5體內(nèi)產(chǎn)生的H2

9、O2水平及crtI基因的表達(dá)水平與等量菌體內(nèi)積累的玉米黃質(zhì)的總量變化趨勢(shì)一致(CA＜CA+BT＜CA+DBT)，且類胡蘿卜素的積累能夠提高菌株生長(zhǎng)量。這表明雜環(huán)降解與細(xì)胞內(nèi)氧化壓力的增加和類胡蘿卜素合成之間存在直接或間接的聯(lián)系。鑒于類胡蘿卜素物質(zhì)的抗氧化作用和親脂性質(zhì)，我們推測(cè)類胡蘿卜素的合成對(duì)雜環(huán)化合物的降解可能具有積極作用，一方面能夠作為抗氧化物清除部分ROS，另一方面還可作為一種親脂的物質(zhì)通過(guò)占據(jù)細(xì)胞膜內(nèi)的位置減少生物異源物進(jìn)入細(xì)

10、胞膜內(nèi)的自由空間，減小CA、BT和DBT等生物異源物與細(xì)胞膜的相互作用，從而減小雜環(huán)降解過(guò)程中產(chǎn)生的ROS對(duì)菌體帶來(lái)的細(xì)胞損傷，最終提高菌株XLDN2-5在環(huán)境中的存活率和持續(xù)且有效地降解雜環(huán)化合物的能力。
　　 此外，我們利用Illumina HiSeq2000對(duì)兩株咔唑降解假單胞菌——淺黃假單胞菌XLDN4-9(Pseudomonas luteola XLDN4-9)和施氏假單胞菌XLDN-R(Pseudomonas stu

11、tzeri XLDN-R)進(jìn)行了全基因組測(cè)序。同時(shí)比較5株已測(cè)序的雜環(huán)化合物降解菌的基因組，并分析了以咔唑?yàn)槲ㄒ惶嫉瓷L(zhǎng)的鞘氨醇桿菌XLDN2-5的蛋白質(zhì)組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除了鞘氨醇單胞菌屬積累類胡蘿卜素外，雜環(huán)降解微生物還存在烷基過(guò)氧化氫還原酶(alkyl hydroperoxide reductase)、過(guò)氧化物酶(catalase)、谷胱甘肽(glutathione)/谷氧還蛋白(glutaredoxin)和硫氧還蛋白(thiored

12、oxin)等多種與抗氧化壓力相關(guān)的酶和蛋白質(zhì)。
　　 根據(jù)本論文的研究結(jié)果可知，在降解雜環(huán)化合物的過(guò)程中，鞘氨醇桿菌XLDN2-5體內(nèi)產(chǎn)生大量的H2O2，其氧化壓力對(duì)細(xì)胞的損傷和對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響可能是降解菌不能持續(xù)降解雜環(huán)化合物，有機(jī)雜環(huán)化合物在環(huán)境中長(zhǎng)期存在的主要原因。在雜環(huán)化合物降解過(guò)程中，XLDN2-5細(xì)胞內(nèi)積累了大量的玉米黃質(zhì)，其含量隨菌體對(duì)雜環(huán)化合物的降解而產(chǎn)生H2O2等ROS的水平變化而變化，玉米黃質(zhì)作為一種非酶類抗