腺苷酸激酶ak4敲除對雄性斑馬魚生殖細胞凋亡的影響.pdf

1、生命的延續(xù)和發(fā)展依賴于生物的繁殖。有關(guān)生殖發(fā)育的研究受到越來越多的關(guān)注。斑馬魚作為一種常用的模式生物，受精和發(fā)育均在體外進行，方便研究。除此之外，作為脊椎動物，斑馬魚的基因同人類基因的功能相似，組織器官的結(jié)構(gòu)同源。因此，在現(xiàn)代生命科學研究的各個方面廣泛使用。腺苷酸激酶(Adenylatekinase，AK)是遍及于植物、動物和微生物體內(nèi)的一種單體酶，在需要高水平腺苷三磷酸(Adenosine triphosphate，ATP)的細胞中大

2、量存在。近年來，人們在細胞凋亡過程中發(fā)現(xiàn)有AK的遷移和酶活的變化，且AK缺陷與人類很多疾病的發(fā)生都有直接關(guān)系。
　　有文獻報道，人的AK1-4、6-7均表達于睪丸和附睪，AK5僅表達于附睪;AK6還表達于精子尾部。但在雄性生殖系統(tǒng)中AK的作用目前知道的還很少。實驗室合作者前期研究發(fā)現(xiàn)，在人類弱精癥患者中，AK相關(guān)基因表達異常。因此，本論文采用CRISPR/Cas9技術(shù)，敲除斑馬魚ak4，研究其對雄性生殖系統(tǒng)中ATP含量和AMP/A

3、TP比例的影響以及對雄性生殖細胞凋亡的影響，為進一步治療與此相關(guān)的疾病提供理論支持。
　　通過序列比對和進化分析，發(fā)現(xiàn)斑馬魚各Ak彼此之間的序列一致性僅為8.5％，說明斑馬魚ak家族基因在序列、功能上有很大分化。qPCR技術(shù)分析斑馬魚各ak在胚胎發(fā)育早期和成體各組織器官的表達，發(fā)現(xiàn)斑馬魚ak7a既有有母源表達，又有合子表達;其他ak以合子表達為主;在精巢中表達的ak有ak1、ak4、ak6、ak7a、ak7b、ak8和ak9。由此

4、明確了ak各亞型在斑馬魚的表達情況，為針對特定的功能研究進行基因敲除提供了線索。隨后采用CRISPR/Cas9技術(shù)，成功敲除斑馬魚腺苷酸激酶ak4基因，并篩選到純合突變體后代。用HPLC方法測定精巢中ATP、ADP、AMP的含量及AMP/ATP比例，結(jié)果表明，突變體精巢中ATP含量顯著減少，AMP含量未發(fā)生明顯變化，AMP/ATP比值升高。說明精巢中細胞的能量狀態(tài)發(fā)生了顯著變化。用TUNEL和FCM檢測，發(fā)現(xiàn)突變體精巢中細胞凋亡增多。結(jié)

5、合其他文獻和本實驗結(jié)果，推測細胞中這種能量變化導致了ak4突變體雄性生殖細胞凋亡。在8h、24 h分別檢測，都發(fā)現(xiàn)ak4雄性突變體后代存活率下降，死亡率上升，推測是由于ak4突變后，細胞凋亡增加導致精子質(zhì)量下降所致。突變體胚胎在發(fā)育早期下包慢，卵黃大，色素淺，身體短，發(fā)育滯后。結(jié)合ak4在早期發(fā)育中的表達，這顯示ak4也參與了早期胚胎發(fā)育過程。
　　另外，還采用CRISPR/Cas9敲除了斑馬魚ak6和ak7a基因，制備了F0代突