微生物谷銨酰胺轉(zhuǎn)銨酶基因的克隆與表達(dá).pdf

1、谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶，又稱轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(Transglutaminase,簡稱Tgase或TG，全稱：protein-transglutayltransferase，EC.2.3.2.13)，其系統(tǒng)名稱為蛋白質(zhì)-谷氨酸-γ-谷氨酰胺基轉(zhuǎn)移酶。谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶以蛋白質(zhì)或多肽中的賴氨酸殘基的ε-氨基作為?；荏w，以肽鏈中的谷氨酰胺殘基的γ-羧酰胺基作為?；w，在蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間形成ε-(γ-glutamyl)lys共價鍵，使蛋白質(zhì)分子發(fā)生交聯(lián)

2、聚合，從而改善蛋白質(zhì)食品的特性，在食品工業(yè)中有非常高的應(yīng)用價值。
　　 谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶廣泛存在于從細(xì)菌到哺乳動物中的各種生物中。動物來源的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶需要Ca2+來暴露其活性區(qū)的半胱氨酸殘基的位點(diǎn)。對于微生物來源的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶研究較少，其主要來源于鏈輪絲菌屬或枯草桿菌屬，前者產(chǎn)生的是胞外酶，而后者的酶主要在孢子上。
　　 從產(chǎn)酶菌株鏈輪絲菌H-197中提取總DNA，設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶全

3、長產(chǎn)酶基因，并進(jìn)行測序驗(yàn)證。通過對基因序列的生物軟件分析，谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶基因有1257對堿基，GC含量為61.4[％]。編碼418個氨基酸，預(yù)計(jì)翻譯的蛋白等電點(diǎn)pI為7.08，分子量為46.6 kD。
　　 設(shè)計(jì)加有Bam HI，Hind Ⅲ及Xho I酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基接頭的特異性引物，擴(kuò)增目的基因片段，進(jìn)行TA克隆，再將其酶切下MTG片段后，將其亞克隆到到pET-28a，pET30a，pET22b，pGEX-4T-1這四種表

4、達(dá)載體上，研究其表達(dá)特性。將得到的亞克隆重組轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化到E.Coli DH5α中進(jìn)行甘油保存，轉(zhuǎn)化到E.Coli BL21(DE3)進(jìn)行表達(dá)研究。需進(jìn)一步的測序驗(yàn)證目的基因與載體是否正確連接以及MTG基因是否發(fā)生突變。
　　 獲得了四種具有重組谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(rMTG)基因重組大腸桿菌菌株，分別為pET28a-MTG/BL21(DE3)、pET30a-MTG/BL21(DE3)、pET22b-MTG/BL21(DE3)、pGE

5、X-4T-1-MTG/BL21(DE3)。
　　 對pET28a-MTG/BL21(DE3)、pET30a-MTG/BL21(DE3)這兩種重組菌株進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)小量表達(dá)，發(fā)現(xiàn)pET28a-MTG/BL21(DE3)菌株在37℃下以1mM IPTG誘導(dǎo)4小時表達(dá)量最大；而pET30a-MTG/BL21(DE3)菌株在37℃下以1mM IPTG誘導(dǎo)5小時表達(dá)量最大。pET28a-MTG/BL21(DE3)菌株的最佳IPTG濃度為

6、0.8mM。pET30a-MTG/BL21(DE3)菌株的最佳IPTG濃度為0.2mM。
　　 對pET22b-MTG/BL21(DE3)、pGEX-4T-1-MTG/BL21(DE3)這兩種重組菌株進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)小量表達(dá)，發(fā)現(xiàn)pET22b-MTG/BL21(DE3)菌株在37℃下以終濃度1mM IPTG誘導(dǎo)2小時下表達(dá)量最大，原因尚需摸索；而pGEX-4T-1-MTG/BL21(DE3)菌株在37℃下以終濃度1mM IPTG

7、誘導(dǎo)4小時表達(dá)量最大，表達(dá)的目的蛋白的大小符合預(yù)期估測值，GST-MTG融合蛋白分子量大小為72.6KD。
　　 根據(jù)正交試驗(yàn)確定pET30a-MTG/BL21(DE3)重組菌株的最佳組合誘導(dǎo)條件為：搖菌轉(zhuǎn)速250r/min、37℃下加入終濃度為1.0mM IPTG誘導(dǎo)4h。
　　 pET30a-MTG/BL21(DE3)菌體經(jīng)裂解超聲后，用SDS-PAGE分析蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果表明重組蛋白主要以包涵體的形式存在于沉淀

8、中；上清含有部分可溶性的重組MTG蛋白，酶活為0.4963U/mL。包涵體蛋白經(jīng)透析復(fù)性法后電泳，發(fā)現(xiàn)在大小約47KD條帶處是一條淺淺的蛋白帶，測酶活為0.4585 U/mL。使用稀釋復(fù)性法后，未見目的條帶，稀釋復(fù)性法未成功。Sephadex G-75凝膠過濾層析復(fù)性，測峰值酶活平均為0.3048U/mL，是一種很好的復(fù)性的方法，溫和而省時。
　　 通過降低溫度誘導(dǎo)的策略，在37℃培養(yǎng)、24℃誘導(dǎo)時，以1mM終濃度的IPTG為誘