嗜熱子囊菌內(nèi)切葡聚糖醋I基因的DNA改組及酶學(xué)性質(zhì)的研究.pdf

1、纖維素是地球上分布最廣、蘊(yùn)藏量最豐富的可再生資源。纖維素的利用與轉(zhuǎn)化對(duì)于解決目前世界所面臨的糧食短缺、環(huán)境污染以及能源危機(jī)等問(wèn)題具有十分重要的意義。纖維素酶可以將纖維素水解成為葡萄糖,這是一條無(wú)污染且能有效利用纖維素的途徑。但目前纖維素酶的成本仍較高,一些纖維素酶具有活性較低或熱穩(wěn)定性較差等缺點(diǎn),通過(guò)定向進(jìn)化可以不斷提高并獲得新性能的重組纖維素酶。本試驗(yàn)以嗜熱子囊菌內(nèi)切葡聚糖酶基因egⅠ為研究對(duì)象,通過(guò)DNA改組技術(shù)對(duì)野生型egⅠ進(jìn)行突

2、變重組,以期獲得高內(nèi)切葡聚糖酶活性、高穩(wěn)定性的突變菌株。本研究主要結(jié)果：
　　 ⑴通過(guò)優(yōu)化DNaseⅠ酶切時(shí)間、無(wú)引物PCR和有引物PCR的模板量等關(guān)鍵因素,建立適合于嗜熱子囊菌內(nèi)切葡聚糖酶基因改組的條件。
　　 ⑵以質(zhì)粒pMD-18T-egⅠ為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得野生型egⅠ,利用DNAshuffling技術(shù),得到大約400個(gè)突變克隆,隨機(jī)挑選20株進(jìn)行測(cè)序和序列分析,突變率達(dá)0.11％～0.43％。
　　

3、 ⑶將含有突變基因的重組質(zhì)粒pMD-18T-egⅠ和酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K用SnaBⅠ、NotⅠ進(jìn)行雙酶切,經(jīng)T4DNA連接酶連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,抽提質(zhì)粒,獲得攜帶不同片段的質(zhì)粒。線(xiàn)性化后,采用LiCl轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞中,MD平板上篩選Mut+His+轉(zhuǎn)化予。陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子在基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá),經(jīng)酶活測(cè)定,篩選出1株活性較高的菌株BY2,酶活為23.75U／mL,比出發(fā)菌株酶活提高了將近10倍。

4、　　 ⑷為得到高表達(dá)基因工程菌株,提取這株突變菌的基因組,以EG-S和EG-A為引物擴(kuò)增該突變基因,序列分析發(fā)現(xiàn)該突變株為13號(hào)突變基因。突變基因與pPIC9K連接,線(xiàn)性化后進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化。通過(guò)活性篩選,得到高活性突變體BY213,在基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)168h后,酶活可達(dá)到78.63U／ml,蛋白含量達(dá)到1.14mg／mL。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳分析,分子量為34.1KDa。
　　 ⑸研究了BY213菌株的內(nèi)切葡聚糖酶酶