內(nèi)源性促生存蛋白Iduna在新生鼠缺氧缺血性腦損傷中的作用.pdf

1、圍產(chǎn)期窒息所致缺氧缺血性(hypoxic-ischemic，HI)腦損傷，是導(dǎo)致新生兒死亡和慢性殘障的主要原因。全球每年用于HI腦病治療和護(hù)理的費(fèi)用給社會、家庭和個人帶來沉重負(fù)擔(dān)。由于新生兒大腦的不同部位對HI損傷呈選擇性，針對特定易損神經(jīng)系統(tǒng)和細(xì)胞群的治療機(jī)會非常有限。探索HI腦損傷確切機(jī)制并尋找有效治療方案，是目前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要課題之一。
　　研究表明，谷氨酸作用與N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體介導(dǎo)的神經(jīng)興奮毒性和氧化

2、應(yīng)激在HI腦損傷中扮演重要角色，我們前期在HI腦損傷動物模型中也證實了這一點(diǎn)。在成年腦缺血模型中，興奮毒性和氧化損傷，可直接或間接激活聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1（PARP1），催化合成大量死亡分子聚腺苷二磷酸核糖（Poly ADP-ribose,PAR）聚合物，誘導(dǎo)線粒體凋亡誘導(dǎo)因子(Apoptosis Inducing Factor，AIF)進(jìn)入細(xì)胞核，導(dǎo)致PARP1依賴性細(xì)胞死亡（Parthanatos）的發(fā)生。新近發(fā)現(xiàn)的NMDA受體

3、誘導(dǎo)產(chǎn)生的存活蛋白Iduna，是一種內(nèi)源性PAR/AIF死亡通路抑制劑，可通過特異性結(jié)合PAR，干擾AIF核轉(zhuǎn)位，從而抑制谷氨酸及其NMDA受體興奮毒性介導(dǎo)的細(xì)胞死亡。上調(diào)Iduna的表達(dá)水平，能夠抑制PAR信號介導(dǎo)的Parthanatos，從而對NMDA受體興奮毒性引起的腦損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。那么Iduna蛋白在新生鼠中的表達(dá)與定位是怎樣的情況？新生鼠HI腦損傷過程中是否同樣存在由PAR介導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞Parthanatos死亡呢？而I

4、duna表達(dá)與AIF的關(guān)系如何？在原代神經(jīng)元細(xì)胞中上調(diào)Iduna后，是否會降低氧糖剝奪(OGD)對細(xì)胞造成的損傷呢？本研究主要有三個部分，實驗一擬研究以新生大鼠為對象，觀察Iduna在腦組織中的表達(dá)及細(xì)胞定位。實驗二擬研究新生大鼠HI腦損傷過程中，大腦皮層損傷與Iduna的關(guān)系，以及Iduna表達(dá)與AIF的關(guān)系。實驗三擬構(gòu)建大鼠Iduna cDNA的慢病毒表達(dá)質(zhì)粒，觀察原代神經(jīng)元細(xì)胞中Iduna上調(diào)后細(xì)胞損傷情況。
　　第一部分：

5、內(nèi)源性促生存蛋白Iduna在新生大鼠腦組織中的表達(dá)及細(xì)胞定位
　　目的：明確內(nèi)源性存活蛋白Iduna在新生大鼠腦組織中的表達(dá)水平及其細(xì)胞定位。
　　方法：取SD新生鼠各器官組織，采用Western-blot評價Iduna蛋白表達(dá)的組織特異性。制作SD新生鼠腦組織石蠟與冰凍切片，通過免疫組織化學(xué)觀察Iduna蛋白在新生鼠腦組織的表達(dá)水平及定位特點(diǎn)，免疫熒光三標(biāo)腦組織冰凍切片確認(rèn)Iduna在神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞中的定位。培養(yǎng)原代

6、神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞，Real-time PCR定量分析Iduna在兩種神經(jīng)細(xì)胞中的表達(dá)水平。在原代神經(jīng)元及星型膠質(zhì)細(xì)胞中通過免疫熒光雙染NeuN和GFAP驗證Iduna的細(xì)胞定位。
　　結(jié)果：Western-blot結(jié)果提示新生鼠肺組織中Iduna表達(dá)水平最高，其次為腦和脊髓組織；腦組織免疫組化染色顯示Iduna主要表達(dá)在皮層和海馬區(qū)域；大腦海馬免疫熒光三標(biāo)提示Iduna主要表達(dá)于神經(jīng)元細(xì)胞的胞漿內(nèi)（79.85％），原代神經(jīng)細(xì)胞

7、的免疫熒光三染也驗證了這一結(jié)果（80.6%）；RT-PCR證實Iduna在神經(jīng)元中的表達(dá)豐度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于星形膠質(zhì)細(xì)胞（P<0.001）。
　　結(jié)論：1、內(nèi)源性存活蛋白Iduna在新生大鼠各器官中的表達(dá)具有組織特異性，腦組織是Iduna高表達(dá)的臟器。2、腦組織中Iduna主要分布在海馬及皮層區(qū)域。3、海馬區(qū)和皮層區(qū)域Iduna均主要定位于神經(jīng)元胞漿中，提示其可能與神經(jīng)元的功能有關(guān)。
　　第二部分:新生鼠缺氧缺血性腦損傷中Iduna

8、和AIF表達(dá)的相關(guān)性
　　目的：觀察7日齡大鼠缺氧缺血性腦損失后腦皮層中Iduna與AIF表達(dá)的變化及相關(guān)性。
　　方法：96只新生大鼠被分為假手術(shù)組，缺氧1h和缺氧2h三組。在缺氧缺血性腦損傷24h后，通過HE染色、尼氏染色、透射電鏡、TUNEL染色和免疫熒光法來評估HI對新生鼠大腦皮層神經(jīng)元存活數(shù)量的影響。免疫組化分析HI對皮層組織Iduna表達(dá)與DNA損傷的影響。用免疫組織化學(xué)和蛋白印跡分析來檢測HI對新生大鼠皮層Id

9、una表達(dá)水平與核內(nèi)AIF含量的影響。并在HI腦損傷1個月時通過Morris水迷宮評估大鼠遠(yuǎn)期的學(xué)習(xí)和記憶能力。
　　結(jié)果：與假手術(shù)組比較，HI腦損傷后大腦皮層結(jié)構(gòu)紊亂、神經(jīng)元存活數(shù)量減少、細(xì)胞亞細(xì)胞器（線粒體）結(jié)構(gòu)破壞以及細(xì)胞DNA斷裂加劇。且缺氧2h比缺氧1h大鼠的腦損傷更加嚴(yán)重。另外，當(dāng)Iduna表達(dá)明顯減少時細(xì)胞核內(nèi)的AIF表達(dá)增加。缺氧2h后Iduna表達(dá)下降并與核內(nèi)AIF表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，有統(tǒng)計學(xué)意義(r=-0.950，P

10、<0.0001)。缺氧后的大鼠遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)和記憶能力均下降。
　　結(jié)論：1、新生鼠缺氧缺血性腦損傷進(jìn)程中，大腦皮層組織損傷嚴(yán)重、神經(jīng)存活數(shù)量減少、神經(jīng)細(xì)胞DNA損傷嚴(yán)重。2、伴隨缺氧缺血時長的增加，皮層組織中內(nèi)源性存活蛋白Iduna含量顯著下降，同時胞核內(nèi)AIF的含量顯著增多。3、出生早期的缺氧缺血損傷能夠顯著影響大鼠遠(yuǎn)期的學(xué)習(xí)記憶能力。
　　第三部分：細(xì)胞水平觀察上調(diào)Iduna對缺氧神經(jīng)元損傷的影響
　　目的：構(gòu)建大鼠I

11、duna cDNA的慢病毒表達(dá)質(zhì)粒(PCDH-Iduna)，包裝Iduna過表達(dá)慢病毒，以期上調(diào)原代神經(jīng)元細(xì)胞中Iduna的表達(dá)。觀察Iduna上調(diào)后對神經(jīng)元細(xì)胞氧糖剝奪后細(xì)胞活性的影響。
　　方法：提取SD大鼠腦組織總RNA，利用RT-PCR的方法獲取大鼠Iduna cDNA序列，將其插入慢病毒過表達(dá)載體PCDH質(zhì)粒中，經(jīng)酶切和測序驗證重組質(zhì)粒PCDH-Iduna。將PCDH-Iduna（以PCDH-EGFP為陰性對照）及包裝質(zhì)

12、粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，包裝Iduna過表達(dá)慢病毒，顯微鏡下觀察HEK293T細(xì)胞的形態(tài)變化，了解病毒包裝情況。用慢病毒感染原代神經(jīng)元細(xì)胞，Western blot檢測靶細(xì)胞中Iduna的表達(dá)效率。待Iduna上調(diào)后，進(jìn)行氧糖剝奪實驗并采用MTT法、LDH和彗星實驗檢測細(xì)胞活性。
　　結(jié)果：瓊脂糖凝膠電泳顯示Iduna的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1068bp左右片段，酶切鑒定可見有約1000bp左右片段釋放，且測序結(jié)果提示克隆正確。

13、將Iduna過表達(dá)慢病毒表達(dá)載體PCDH-Iduna及包裝質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞后，鏡下可見細(xì)胞呈現(xiàn)出毒時特有的致細(xì)胞病變效應(yīng)。Iduna過表達(dá)慢病毒及其對照病毒感染原代神經(jīng)元細(xì)胞，免疫熒光及Western-blot檢測提示病毒感染的神經(jīng)元細(xì)胞中Iduna表達(dá)增加。MTT檢測顯示，氧糖剝奪可導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞存活率顯著下降(P<0.01)，而Iduna過表達(dá)后可顯著抵抗氧糖剝奪引起的神經(jīng)元細(xì)胞存活率下降(P<0.5)。LDH漏出率檢

14、測，氧糖剝奪可使神經(jīng)元乳酸脫氫酶漏出率增加(P<0.001)，而Iduna過表達(dá)后可減少氧糖剝奪引起的乳酸脫氫酶漏出(P<0.5)。彗星實驗得出上調(diào)Iduna可以減少OGD對神經(jīng)元DNA完整性的損傷。
　　結(jié)論：1、成功構(gòu)建了慢病毒過表達(dá)重組質(zhì)粒PCDH-Iduna。2、包裝獲得了具有良好感染效率的Iduna過表達(dá)慢病毒，顯著上調(diào)了原代神經(jīng)元細(xì)胞中Iduna的表達(dá)水平。3、上調(diào)Iduna的表達(dá)可顯著抑制OGD引起的神經(jīng)元損傷（如改