Notch配體DLL4在手足口病患兒中表達(dá)、臨床意義和功能分析.pdf

1、手足口病是一種危及全世界兒童健康的急性傳染病。在中國(guó)，每年至少數(shù)百萬(wàn)兒童感染手足口病，并有數(shù)百例危重癥病例死亡。手足口病可由EV71（腸道病毒71）和CVA16（柯薩奇病毒A16）等病毒感染所致，伴有顯著的免疫紊亂，表現(xiàn)為炎癥T細(xì)胞的異常增殖和分化所導(dǎo)致的異常的炎癥因子分泌。Notch信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、分化和凋亡等各種生理、病理狀態(tài)中發(fā)揮著重要的作用。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)可通過(guò)細(xì)胞因子非依賴途徑調(diào)控T淋巴細(xì)胞分化。我們希望通過(guò)

2、本次研究，闡明Notch信號(hào)通路在手足口病發(fā)病中的可能機(jī)制，為開(kāi)發(fā)手足口病有效預(yù)防和治療策略提供重要理論依據(jù)。
　　第一部分、Notch配體DLL4在手足口病患兒中表達(dá)和臨床意義
　　目的：了解Notch信號(hào)通路在手足口病發(fā)病中的作用。
　　方法：2012年6月～2012年12月蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院感染病房和兒科重癥監(jiān)護(hù)病房收住的82例手足口病患兒，設(shè)為手足口病組，根據(jù)其臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室結(jié)果分為單純組和腦炎組，對(duì)照組為

3、外科腹股溝斜疝擇期手術(shù)患兒40例，將其流行病學(xué)、臨床理化特征、外周血免疫細(xì)胞水平和Notch配體水平進(jìn)行分析比較。
　　結(jié)果：
　　1.手足口病組外周血單個(gè)核細(xì)胞中Notch配體DLL1和DLL4的mRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（P<0.05），而Jagged1和Jagged2的表達(dá)在兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，四種配體在手足口病單純組和腦炎組之間表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定手足口病組外周血中樹(shù)突狀細(xì)

4、胞(DCs)表面 DLL4表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（P<0.05），健康志愿者外周血DCs表面不表達(dá)DLL4。
　　3.手足口病組外周血CD3+細(xì)胞、CD3+CD4+細(xì)胞和CD3+CD8+細(xì)胞水平顯著低于對(duì)照組，CD3-CD19+細(xì)胞水平顯著高于對(duì)照組（P<0.05），手足口病單純組CD3+細(xì)胞、CD3+CD4+細(xì)胞水平顯著高于腦炎組，CD3-CD19+細(xì)胞水平顯著低于腦炎組（P<0.05），而CD3+CD8+和CD3-CD16+C

5、D56+細(xì)胞水平兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.手足口病組外周血單個(gè)核細(xì)胞中DLL4的RNA表達(dá)水平和CD3+淋巴細(xì)胞表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.23，P=0.00），與 CD3+CD8+淋巴細(xì)胞表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.23，P=0.02），與 CD3-CD19+淋巴細(xì)胞呈正相關(guān)（r=0.36，P=0.00），而DLL4表達(dá)與CD3+CD4+細(xì)胞和CD3-CD16+56+細(xì)胞無(wú)顯著相關(guān)。
　　5.手足口病組外周血單個(gè)核細(xì)胞中DL

6、L4的RNA表達(dá)水平與腦脊液中WBC總數(shù)呈正相關(guān)（r=0.45，P=0.01），與腦脊液總蛋白含量（S-TP）呈正相關(guān)（r=0.37，P=0.01）（見(jiàn)圖2）。
　　結(jié)論：Notch信號(hào)通路可能參與手足口病的發(fā)??；Notch配體 DLL4與外周血CD3+，CD3+CD8+和CD3-CD19+淋巴細(xì)胞有較強(qiáng)的相關(guān)性，可能通過(guò)影響這些免疫細(xì)胞的數(shù)量和狀態(tài)從而影響疾病的預(yù)后，另DLL4與腦脊液中WBC和總蛋白水平顯著相關(guān)，可能成為判斷手

7、足口病并發(fā)腦炎的一個(gè)指標(biāo)。
　　第二部分、人DLL4+DCs對(duì)CD4+T細(xì)胞向Th1及Th17分化的調(diào)控
　　目的：了解體外炎癥環(huán)境下DLL4+DCs能否調(diào)控CD4+T細(xì)胞向Th1及Th17分化。
　　方法：體外采用不同的Toll樣受體激動(dòng)劑刺激從健康志愿者外周血分離獲得的
　　PBMCs來(lái)模擬體內(nèi)的炎癥環(huán)境，測(cè)定刺激后樹(shù)突狀細(xì)胞（DCs）表達(dá) DLL4水平和DCs活化狀態(tài)。
　　分離純化健康志愿者外周血D

8、Cs經(jīng)過(guò)R848刺激獲得DLL4+DCs，與來(lái)自不同志愿者的純化后的CD4+T淋巴細(xì)胞以1:10的比例共培養(yǎng)，采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)IFN-a和IL-17等細(xì)胞因子表達(dá)水平，分析DLL4+DCs對(duì)CD4+T淋巴細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)作用。
　　結(jié)果：
　　1.健康志愿者外周血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同Toll受體激動(dòng)劑Pam3CSK4、LPS和R848刺激24h，均能誘導(dǎo)DCs表達(dá)DLL4（18.2％～24.7%）。
　　2.R8

9、48刺激顯著上調(diào)了DCs表面HLA-DR、CD40、CD80、CD83和CD86的表達(dá)水平；R848可以誘導(dǎo)DCs表達(dá)IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TNF-α和IL-6的mRNA顯著增加。
　　3.經(jīng)過(guò)R848刺激的DCs和CD4+T細(xì)胞以1:10的比例共培養(yǎng)7天，相對(duì)于對(duì)照組，觀察組誘導(dǎo)輔助T細(xì)胞表達(dá)包括更多IFN-γ和IL-17，提前加入DLL4+特異性中和抗體能夠降低IFN-γ和IL-17的水平。
　　結(jié)論：體外