中國沈陽地區(qū)孕婦和新生兒維生素D水平調(diào)查及Vitamin D-VDR通路抑制TNBS誘導型腸炎進展的機制研究.pdf

1、維生素D（Vitamin D）是一種脂溶性維生素，其最重要的作用是調(diào)節(jié)鈣磷代謝，促進鈣的吸收、重吸收和鈣在骨骼的沉積。發(fā)育中胎兒的鈣含量完全依賴于母體的鈣源，動物和人類的數(shù)據(jù)研究均表明懷孕期間孕婦維生素D缺乏是對孕產(chǎn)婦、胎兒和兒童的健康產(chǎn)生不良影響的一個重要危險因素。因此，人們越來越擔心孕婦維生素缺乏D對新生兒的影響。母體維生素D缺乏與許多胎兒和新生兒健康問題緊密相關(guān)，如骨發(fā)育障礙、多發(fā)性硬化、癌癥、胰島素依賴型糖尿病、哮喘、子癇前期、

2、低出生體重、妊娠期糖尿病等。之前已有研究表明維生素D缺乏的風險因素包括皮膚黑色素沉積、定期使用防曬霜、母親肥胖和生活在高緯度地區(qū)，特別是在春冬季節(jié)。維生素D水平不僅受季節(jié)的影響，而且與緯度的高低、膚色及地區(qū)生活習慣緊密相關(guān)。早產(chǎn)兒患有短期和長期并發(fā)癥的風險更大，包括身體殘疾和精神方面的障礙。在所有產(chǎn)婦維生素D缺乏的不良結(jié)果中，早產(chǎn)是最有害的。相比健康的新生兒，早產(chǎn)兒出生時25羥基維生素D(25(OH)D)血漿濃度較低。25(OH)D補充

3、不僅能增加孕婦骨的再吸收，同時還增強其新生兒的骨量。另一項研究動態(tài)地比較了患有不同程度的維生素D缺乏嬰兒的骨標記物，結(jié)果表明，除了骨鈣素外，嬰兒在最初幾個月補充維生素D會對骨代謝生化標志物產(chǎn)生影響。盡管維生素D缺乏已受到全球的關(guān)注，但因緯度、季節(jié)、膚色等因素的限制，導致對于維生素D缺乏的研究存在局限性，并且在世界范圍內(nèi)缺乏對于中國人口維生素D缺乏的流行病學研究。因此在中國地區(qū)進行維生素D水平的調(diào)查，探究母體維生素D缺乏對新生兒的影響是十

4、分必要的。
　　炎性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）是一種慢性的、復發(fā)與緩解反復作用的炎性胃腸道疾病，其通常表現(xiàn)為兩種主要形式:克羅恩病(Crohn disease，CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)。越來越多的流行病學數(shù)據(jù)顯示，維生素D缺乏與炎性腸病的發(fā)生存在一定的關(guān)系，并且炎性腸病患者普遍存在維生素D缺乏。由于維生素D受體(VDR)在腸上皮細胞(IECs)高度

5、表達，因此Vitamin D/VDR信號通路很可能在慢性炎性腸病的發(fā)病機制中扮演關(guān)鍵角色。
　　腸上皮屏障由單層上皮細胞和鄰近細胞間的緊密連接組成，是腸粘膜上皮層的高度選擇性屏障，正是這種屏障在結(jié)腸炎的發(fā)生及發(fā)展中起著重要的作用。
　　目的:
　　腸上皮細胞的異常凋亡是腸道滲透率增加和腸道炎癥的一個重要病理生理機制。腸上皮細胞的過度凋亡會引起上皮屏障的破壞，從而導致腸道通透性的增加，進而使炎癥物質(zhì)侵入。這些有害物質(zhì)可以

6、導致結(jié)腸固有層中炎性細胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，這一系列的惡性腸道活動促進了結(jié)腸炎癥的發(fā)生，最終導致慢性炎性腸病。最新研究表明，VDR轉(zhuǎn)基因鼠較野生型鼠的腸炎發(fā)病率低，這一研究提示VDR在腸炎的發(fā)生發(fā)展中起到了保護作用。我們的假設(shè)是，維生素D的治療能夠通過減輕腸上皮細胞的凋亡而抑制2，4，6-三硝酸苯磺酸(TNBS)誘發(fā)型腸炎的進展。
　　方法:
　　本研究所涉及患者和正常對照人群的樣本均來自中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院。所有樣本

7、的留取及使用均已征得本人的同意，并告知用于科學研究。本課題的研究已經(jīng)得到中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院醫(yī)學道德倫理委員會的批準。所有動物實驗也經(jīng)過中國醫(yī)科大學動物倫理委員會的批準。
　　一、中國沈陽地區(qū)孕婦和新生兒維生素D水平調(diào)查
　　于2011年10月至2012年10月期間在中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院產(chǎn)科住院選擇剖宮產(chǎn)終止妊娠孕婦共1103例中選取821例。維生素D缺乏被定義為血清25(OH)D≤50 nmol/L，并進一步分為嚴

8、重缺乏(≤25 nmol/L)和輕度缺乏(25-50nmol/L)。血清25(OH)D水平為50到75 nmol/L定義為維生素D不足。血清25(OH)D75 nmol/L以上定義為維生素D充足。血清濃度測定使用人25羥基維生素D Elisa試劑盒，同時，骨標志物也采用相應的Elisa試劑盒進行測量。所有的數(shù)據(jù)均由SPSS17.0統(tǒng)計。數(shù)據(jù)應用平均數(shù)加減標準差（Mean±SD）來表示。組間比較采用t檢驗，統(tǒng)計兩數(shù)據(jù)間線性關(guān)系采用一般線性

9、分析，P＜0.05為有差異。
　　二、Vitamin D/VDR信號通路抑制TNBS誘導型腸炎進展的機制研究
　　人體標本:
　　IBD組標本來源于2011年1月至2012年12月盛京醫(yī)院消化內(nèi)鏡科的CD和UC的患者。正常組標本來源于進行內(nèi)窺鏡檢查排除CD、UC和腸道疾病的腸道健康患者（對照組為22例，UC組12例，CD組為13例）。
　　腸炎誘導:
　　本次實驗用TNBS注射致腸炎模型，實驗采用雄性成年C

10、57BL6/J小鼠進行動物模型建立，體重為20-25g。腹腔注射雞尾酒麻醉藥物使小鼠麻醉后，用18號不銹鋼注射器經(jīng)肛進行不同劑量同濃度TNBS結(jié)腸注射(TNBS，用50％乙醇溶解)，治療不同劑量同濃度的TNBS經(jīng)推入小鼠結(jié)腸(100mg/kg)，對照組使用不含TNBS同體積的50％酒精，每組16只小鼠。
　　維生素D治療及分組:
　　TNBS組和對照組分別隨機分成兩組（共四組，每組8只）:一組進行維生素D的類似物帕立骨化醇(

11、paricalcitol)進行腹腔注射治療，將帕立骨化醇按(90∶10的比例)溶入丙二醇，劑量為0.5μg/kg;另外一組只不含藥物的同劑量丙二醇。時間點選為TNBS注射時間的30分鐘前一次，之后1天、3天、5天各注射一次，共4次。分組情況:TNBS+ vehicle組（VE組:安慰劑組），TNBS+vitamin D組(VD組:維生素D治療組)，control+vehicle組和control+vitamin D組。
　　實驗方

12、法
　　利用熒光實時定量PCR(Quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)和蛋白印跡(Western Blot)檢測對照組和IBD患者組中腸組織的VDR蛋白和基因表達，檢驗TNBS模型中TNF-α、IFNγ、IL-17、IL23、IL1β、IL6、MCP-1和B2M基因的表達和p53，P53正向細胞凋亡調(diào)控因子(PUMA)和Caspase3蛋白表達，并對其表達

13、進行定量與比較分析。利用ELISA方法測量對照組和IBD患者組血清中25(OH)D水平，并比較分析。利用FD4對TNBS模型中四組腸管進行通透性測定，并比較分析。
　　結(jié)果:
　　一、中國沈陽地區(qū)孕婦和新生兒維生素D水平調(diào)查
　　對母體維生素D水平與新生兒維生素D水平進行一般線性分析，兩者呈強正相關(guān)(r=0.684，P=0.000)。在春季和夏季孕婦25(OH)D水平有顯著性差異(P＜0.0001)，同時春季和秋季之間

14、差異明顯(P＜0.01)。與其他季節(jié)相比，冬季25(OH)D水平最低(夏季vs冬季P＜0.0001，秋季vs冬季P＜0.0001)。母體維生素D水平顯示呈明顯的月和季節(jié)變化，夏季最高，冬季最低。嚴重早產(chǎn)組與足月產(chǎn)組、重度早產(chǎn)組與輕度早產(chǎn)組中的維生素D水平之間存在著顯著差異（重度早產(chǎn)vs輕度早產(chǎn)P＜0.01，重度早產(chǎn)vs足月產(chǎn)＜0.001）。重度早產(chǎn)組中63.04％患有維生素D缺乏，高于足月產(chǎn)組(36.61％)。孕婦血清中CTX、OPG、

15、OPN、PYD的濃度與其25(OH)D濃度均呈正相關(guān)(r=0623，0.655，0.697和0.721，all P=0.000)。新生兒血清中CTX、OPG、OPN、PYD的濃度與其25(OH)D濃度均呈正相關(guān)(r=0623，0.655，0.697和0.721, all p=0.000)
　　二、Vitamin D/VDR信號通路抑制TNBS誘導型腸炎進展的機制研究
　　本研究證實IBD患者中，CD組和UC組的25(OH)D

16、水平明顯低于對照組。Western Blot顯示VDR在UC組、CD組的含量明顯低于對照組(P＜0.05)，同時VDR基因在UC組和CD組的表達明顯高于對照組(P＜0.05)。我們用TNBS建立小鼠腸炎模型來模仿IBD的病理過程，VD組小鼠體重減輕較少。VE組腸管出現(xiàn)嚴重的出血，炎癥細胞浸潤以及正常上皮屏障的破壞，VD組小鼠腸道組織學損傷較輕。VE組炎性因子和趨化因子的mRNA的表達較VD組明顯升高，說明Vitamin D對炎癥有抑制作

17、用。VD組FD4的血清水平明顯低于VE組(p＜0.05)。Westemblot顯示帕立骨化醇的治療使VD組中caspase-3和PUMA的表達較VE組顯著減弱(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、沈陽地區(qū)孕婦及其新生兒維生素D的狀況與同緯度地區(qū)相比較好。孕婦維生素D缺乏在冬季最嚴重，在夏季最輕。嚴重早產(chǎn)的妊娠孕婦維生素D缺乏較重。
　　2、Vitamin D通過Vitamin D/VDR通路下調(diào)PUMA，降低腸上皮細