新型隱球酵母中高親和性銅轉(zhuǎn)運(yùn)因子CNCtr4的功能鑒定.pdf

1、新型隱球酵母，作為一種致病真菌，能夠感染人及動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引發(fā)致病性腦膜炎。盡管它屬于機(jī)會(huì)性致病菌，感染人群大部分是免疫力缺陷的人群，例如HIV病毒攜帶者，器官移植產(chǎn)生排異現(xiàn)象的患者以及接受大量類固醇藥物治療的病人，但是也能感染免疫力正常的人群。最近人們發(fā)現(xiàn)新型隱球酵母的毒性因子與銅離子的代謝存在一定的聯(lián)系。眾所周知，銅離子是細(xì)胞生長(zhǎng)必不可少的元素，因?yàn)樗鳛檩o助因子參與生物的許多重要生命過程，如呼吸作用，多肽激素合成，氧化還原保

2、護(hù)機(jī)制，色素的形成以及細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。本文中通過同源重組的方法，將新型隱球酵母體內(nèi)負(fù)責(zé)編碼高親和性的銅轉(zhuǎn)運(yùn)因子的CTR4基因進(jìn)行敲除，然后研究新型隱球酵母的許多毒性因子的變化情況。 本文中首先通過Southern blot的方法對(duì)一株CTR4缺失疑似菌株進(jìn)行確認(rèn)，然后通過轉(zhuǎn)化完整的CTR4基因片段的方法獲得CTR4基因缺失菌株的回補(bǔ)菌株，通過一系列的試驗(yàn)對(duì)野生型菌株，缺失菌株以及回補(bǔ)菌株在多方面進(jìn)行研究，主要內(nèi)容以及結(jié)果如下：

3、 1．CTR4基因的表達(dá)受到銅離子水平的影響。提取在缺銅，大量含有銅離子，以及正常條件下生長(zhǎng)的新型隱球酵母的總RNA，進(jìn)行RT-PCR，發(fā)現(xiàn)CTR4基因在缺銅條件下大量表達(dá)，而在富含有銅的條件下表達(dá)受到抑制，而且沒有添加銅離子的完全培養(yǎng)基中CTR4基因的表達(dá)介于前兩者之間。 2．CTR4對(duì)銅離子的吸收的影響。實(shí)驗(yàn)中采用了原子吸收光譜的方法對(duì)這三株菌進(jìn)行測(cè)試，試驗(yàn)結(jié)果為：野生型H99，2.01μg/10<'8>個(gè)細(xì)胞，△ct

4、r4，0.661μg/10<'8>個(gè)細(xì)胞，△Actr4：CTR4，1.41μg/10<'8>個(gè)細(xì)胞。從結(jié)果中可以看出，由于CTR4基因的缺失，新型隱球酵母從體外獲得銅離子的能力顯著降低。 3．CTR4基因的細(xì)胞內(nèi)定位。本實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建了質(zhì)粒pBS-Ctr4-GFP，然后通過電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞內(nèi)，通過熒光顯微鏡以及共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)熒光集中在酵母細(xì)胞的細(xì)胞膜位置上，表明CTR4基因編碼的蛋白為膜蛋白。 4．CTR

5、4對(duì)碳源利用的影響。當(dāng)在含有去甲腎上腺素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，△ctr4的黑色素形成能力與野生型一致，沒有發(fā)生明顯的變化。而在以非發(fā)酵性碳源為主要碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，△ctr4菌株的生長(zhǎng)較野生型菌株緩慢，長(zhǎng)成小菌落。顯然是受到了銅離子含量減少的影響。 5．CTR4對(duì)Cu，Zn-SODl酶活力的影響。在含有1μgml維生素K的YNB培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，與野生型的新型隱球酵母相比，△ctr4的生長(zhǎng)受到很大的抑制。 6．CTR4對(duì)