廣西巴馬小型豬T2DM相關miRNAs表達差異及調控機制初步研究.pdf

1、糖尿病是人類三大慢性疾病之一，以Ⅱ型糖尿病居多。Ⅱ型糖尿病主要是由于機體的胰島素抵抗作用進而導致全身能量代謝紊亂的疾病，患者在患病后期會出現(xiàn)糖尿病腎病、心臟病等并發(fā)癥，嚴重威脅人類健康。近年來研究發(fā)現(xiàn)，小分子miRNAs能夠參與Ⅱ型糖尿病的調控。本研究的目的是測定廣西巴馬小型豬miRNAs的組織表達譜;對廣西巴馬小型豬Ⅱ型糖尿病模型不同組織miRNAs的表達差異進行分析;探討miR-103/107在體外和體內對Ⅱ型糖尿病的調控機制，為人

2、類糖尿病的研究、治療提供新的靶點。
　　參照miRBase公布的miR-103、107、122、143-5p基因序列，設計特異性的擴增引物，克隆廣西巴馬小型豬miR-103、107、122、143-5p基因的成熟序列。利用實時熒光定量PCR測定巴馬小型豬miRNAs的組織表達譜。結果顯示巴馬小型豬miR-103、107、122、143-5p與miRBase公布的豬、人類、小鼠、綿羊、雞等物種序列一致，未出現(xiàn)堿基突變;miR-122

3、在肝臟組織中特異性的表達，且表達量顯著高于其他miRNAs(P＜0.05);miR-103、107、143-5p在肝臟、骨骼肌、脂肪組織中均有表達，且miR-103在骨骼肌和脂肪組織中的表達量顯著高于miR-143-5p和miR-122(P＜0.05)。通過實時熒光定量PCR的方法測定T2DM模型發(fā)病組、未發(fā)病以及對照組的肝臟、骨骼肌、脂肪組織中miR-103、107、122的表達水平，結果顯示發(fā)病組肝臟組織中miR-122的表達量上調

4、，miR-103/107在發(fā)病組三個組織中的表達量均上調。因此篩選miR-103/107進行后續(xù)研究。
　　利用miRDanda、Targetscan網(wǎng)站以及文獻報道預測miR-103/107能夠與人和小鼠Caveolin-1基因的3'UTR區(qū)結合，存在三個結合位點，與NCBI公布的豬Caveolin-1基因序列進行比對，豬Caveolin-1基因3'UTR區(qū)存在一個miR-103/107結合位點。本試驗克隆巴馬小型豬Caveol

5、in-1基因包含3'UTR區(qū)域的1885 bp基因序列，與GenBank中公布的豬Caveolin-1基因3'UTR序列比對，結果顯示巴馬小型豬Caveolin-1基因3'UTR存在8處堿基突變，1處堿基缺失，1處堿基插入，同源性為99.6％，巴馬小型豬Caveolin-1基因3'UTR序列在1658-1715 bp存在一處miR-103/107的結合位點。本試驗構建pEGFP-C1-pre-103、pcDNA3.1(+)-EGFP-p

6、re-103、pEGFP-C1-pre-107、pcDNA3.1(+)-EGFP-pre-107真核表達載體，轉染小鼠成肌細胞C2C12，實時熒光定量PCR檢測miR-103/107、Caveolin-1基因在細胞內的表達情況。結果顯示C2C12細胞內轉染pEGFP-C1-pre-103、pcDNA3.1(+)-EGFP-pre-103真核表達載體后miR-103的表達量上調，C2C12細胞內轉染pEGFP-C1-pre-107、pcD

7、NA3.1(+)-EGFP-pre-107真核表達載體后miR-107的表達量上調;在C2C12細胞內過表達miR-103/107后，Caveolin-1基因的表達量均下調。結果表明，在體外過表達miR-103/107能夠直接抑制靶基因Caveolin-1的表達水平。
　　采用實時熒光定量PCR測定巴馬小型豬T2DM模型肝臟、骨骼肌、脂肪組織中Caveolin-1的表達水平。結果表明，巴馬小型豬發(fā)病組Caveolin-1在三個組織

8、中的表達量均下調。對巴馬小型豬T2DM模型中發(fā)病組和未發(fā)病組Caveolin-1基因與miR-103/107的結合區(qū)域進行PCR擴增并測序，結果顯示在Caveolin-1基因與miR-103/107結合區(qū)域的1683 bp位點存在A/T突變，發(fā)病組有AA基因型豬3頭、AT基因型豬3頭，未發(fā)病組AT基因型豬1頭、TT基因型豬2頭。
　　綜上所述，巴馬小型豬T2DM模型發(fā)病組肝臟組織miR-122表達量上調;miR-103/107在發(fā)