肺炎克雷伯菌噬菌體的分離和生物學(xué)特性分析及體外殺菌實(shí)驗(yàn).pdf

1、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumonia，KPN)為臨床常見(jiàn)革蘭氏陰性桿菌，屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)克雷伯菌屬(klebsiella)。該菌廣泛分布于自然界，近年來(lái)成為僅次于大腸桿菌的最重要的條件致病菌，嚴(yán)重地危害著人類的健康和生命。 噬菌體(Bacteriophage)是細(xì)菌的病毒，它與宿主菌關(guān)系密切。一方面，溶原性噬菌體通過(guò)自身攜帶的外源性遺傳物質(zhì)改變宿主菌的生物學(xué)性狀，同時(shí)，在與宿主

2、菌基因組不斷的重組、整合、轉(zhuǎn)座和切離過(guò)程中彼此交換遺傳物質(zhì)，影響宿主菌及自身基因的多樣性。另一方面，裂解性噬菌體能特異性裂解宿主菌，如果誘導(dǎo)前噬菌體進(jìn)入裂解性生長(zhǎng)周期也可導(dǎo)致細(xì)菌裂解，噬菌體有望發(fā)展成為抗細(xì)菌感染的生物制劑。不斷分離新的噬菌體和描述其基本的生物學(xué)特性是噬菌體研究人員的首要任務(wù)。 本研究以臨床分離的肺炎克雷伯菌肺炎亞種為宿主菌，從處理前污水中成功分離出肺炎克雷伯菌的噬菌體，并對(duì)其基本的生物學(xué)特性進(jìn)行了描述，最后對(duì)其

3、體外殺菌能力進(jìn)行了評(píng)估。本研究主要的研究?jī)?nèi)容及實(shí)驗(yàn)結(jié)果包括以下幾個(gè)方面： 1.以肺炎克雷伯菌臨床分離株為宿主菌，從醫(yī)院污水處理站處理前污水中成分離出肺炎克雷伯菌噬菌體一株，并命名為KPNP1。噬菌體：KPNP1形成的噬斑較大，圓形，直徑約4～7mm，透明，表現(xiàn)為裂解性噬菌體的噬斑特征，滴度測(cè)定其滴度為6.1×1011PFU/ml。電鏡下可見(jiàn)噬菌體KPNP1有一個(gè)多面體立體對(duì)稱的頭部，頭部直徑約為180nm，無(wú)囊膜，有一長(zhǎng)尾，尾長(zhǎng)

4、約210nm，尾寬約30nm，屬于長(zhǎng)尾噬菌體科。 2.感染復(fù)數(shù)(multiplicityofinfection，MOI)是指噬菌體感染宿主菌時(shí)噬菌體數(shù)量與宿主菌數(shù)量的比值，也稱感染倍數(shù)。最佳感染復(fù)數(shù)是噬菌體與宿主菌作用所能產(chǎn)生最佳效果時(shí)噬菌體數(shù)量與宿主菌數(shù)量的比值，本實(shí)驗(yàn)KPNP1感染其宿主的最佳感染復(fù)數(shù)為4。 3.一步生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)表明：KPNP1在37℃溫育條件下，15min內(nèi)吸附宿主菌的百分率為72％。感染宿主菌的潛伏期

5、約為35min，裂解期約為40min，裂解量為94PFU/cell。 4.絲裂酶素C誘導(dǎo)法和紫外線誘導(dǎo)法處理可疑溶原性細(xì)菌后均不能形成噬斑，說(shuō)明KPNP1為非溶原性噬菌體，而是裂解性噬菌體。 5.KPNP1的宿主譜比較窄，僅對(duì)少量(1/30)肺炎克雷伯菌肺炎亞種敏感，對(duì)部分大腸埃希菌也敏感。 6.體外殺菌試驗(yàn)表明KPNP1對(duì)KPN懸液的殺菌作用明顯，噬菌體濃度在1.8×1010PFU/ml時(shí)，反應(yīng)達(dá)100分鐘時(shí)的

6、殺滅有效率為81.1％，噬菌體濃度在1.8×109PFU/ml時(shí)，反應(yīng)達(dá)100分鐘時(shí)的殺滅有效率為82.3％，而低濃度噬菌體液隨著時(shí)間的延長(zhǎng)也能達(dá)到相同的殺菌效果。 7.以泌尿管外科常用硅橡膠導(dǎo)尿管為材料，成功構(gòu)建出耐藥KPN的生物膜，并對(duì)形成的生物膜用KPNP1處理2小時(shí)，結(jié)果表明：KPNP1對(duì)導(dǎo)尿管KPN生物膜的殺菌作用較明顯，殺菌有效率為71.8％，電鏡觀察也顯示KPNP1作用前導(dǎo)尿管上KPN細(xì)菌生長(zhǎng)旺盛，細(xì)菌聚團(tuán)生長(zhǎng)現(xiàn)象