五味子木脂素對(duì)環(huán)孢素A藥動(dòng)學(xué)及腎毒性的影響研究.pdf

1、目的:
　　環(huán)孢素A(CyclosporineA，CsA)作為一種強(qiáng)效的免疫抑制劑，被普遍的應(yīng)用于器官移植和自身免疫性疾病的治療。盡管其有強(qiáng)效的治療作用，但其引發(fā)的副作用，如急性、慢性腎臟損傷、嚴(yán)重的高血壓和神經(jīng)毒性，很大程度上限制了它在臨床上的長期使用。五味子木脂素源于中國傳統(tǒng)中藥五味子（Schisandra chinensis）成熟果實(shí)，長期應(yīng)用于中醫(yī)的臨床應(yīng)用治療中，具有多種藥理活性，如抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗菌以及保肝、護(hù)

2、心、益腎等作用，主要應(yīng)用于治療肝炎、腎臟功能不全、神經(jīng)衰弱等疾病。在中國，應(yīng)用以CsA為基礎(chǔ)免疫抑制劑治療時(shí)，用藥方案往往聯(lián)合五味子及其制劑以防治CsA引發(fā)的腎臟毒性，但二藥聯(lián)合應(yīng)用的機(jī)制尚不完全清楚。因此，本文旨在以臨床上常用的免疫抑制劑CsA及五味子提取物和五味子乙素為主要研究對(duì)象，采用LC/MS/MS技術(shù)研究五味子提取物單次給藥對(duì)CsA藥動(dòng)學(xué)影響，并在此基礎(chǔ)上，深入探討五味子木脂素聯(lián)合CsA合并用藥后防治CsA腎臟毒性的潛在機(jī)制，

3、為科學(xué)闡釋五味子防治CsA腎臟毒性的科學(xué)內(nèi)涵提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1.建立測定CsA在生物樣品中LC/MS/MS分析方法
　　采用Hypersil BDS C18柱(2.1×50mm，3.5μm，Waters, USA)為固定相，流動(dòng)相為甲醇和含10mM乙酸銨水溶液(80∶20);流速為0.2mL/min，樣品進(jìn)樣量為10μL，柱溫為60℃，以FK520為內(nèi)標(biāo)物，用電噴霧離子源(ESI)，正離子模式進(jìn)行多反應(yīng)

4、模式檢測，并對(duì)方法學(xué)的專屬性、精密度、準(zhǔn)確度、基質(zhì)效應(yīng)、提取回收率、線性范圍、穩(wěn)定性進(jìn)行考察。
　　2.五味子提取物(SCE)單次給藥對(duì)CsA藥動(dòng)學(xué)影響研究
　　雄性SD大鼠，隨機(jī)分組后分別灌服蒸餾水、不同劑量的五味子提取物溶液(54、108、216mg/kg)，約10min后在灌胃給予CsA（25mg/kg）后，于給藥后5、15、30、45(min)、1、2、3、4、6、8、12、24、36、48(h)從大鼠眼眶后靜脈血管

5、叢取血約0.4mL，置于肝素化的1.5mL離心管中，對(duì)血樣除蛋白，濃縮樣品，復(fù)溶，LC/MS/MS分析。求得藥-時(shí)曲線并用DAS2.1藥動(dòng)學(xué)軟件處理藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。
　　3.五味子提取物(SCE)對(duì)CsA致腎毒性保護(hù)作用的體內(nèi)研究
　　采用低鈉飲食，口服灌胃CsA復(fù)制出大鼠CsA腎毒性。五味子、CsA及二者聯(lián)合給藥SD大鼠，觀察五味子對(duì)CsA腎毒性大鼠的一般情況的影響。連續(xù)給藥28天后，收集血清、腎臟等組織。評(píng)價(jià)各組藥物處理對(duì)大

6、鼠腎損傷情況:測定血清肌酐(sCr)、尿素氮(BUN)水平;五味子提取物對(duì)CsA致大鼠腎毒性氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)如丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)分析測定;腎臟組織切片進(jìn)行H&E染色和Masson's染色，進(jìn)行腎臟病理結(jié)構(gòu)分析，考察五味子對(duì)CsA腎毒性炎癥細(xì)胞浸潤和慢性腎小管間質(zhì)纖維化的影響。Western blotting檢測4-HNE、HO-1、Nrf2、P-gp、Cleaved caspase

7、3、Bax、LC3A/B檢測腎組織蛋白表達(dá)，研究五味子在CsA腎毒性中的保護(hù)作用。
　　4.五味子乙素(SchB)對(duì)CsA致HK-2細(xì)胞氧化應(yīng)激、凋亡和自噬的影響作用研究
　　常規(guī)培養(yǎng)HK-2細(xì)胞，MTT法分別檢測CsA、SchB及二者聯(lián)用對(duì)HK-2細(xì)胞存活率的影響;SchB預(yù)處理HK-2細(xì)胞，考察二藥聯(lián)用對(duì)HK-2細(xì)胞LDH、GSH、ROS、MMP變化的影響;AnnexinⅤ-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測對(duì)細(xì)胞凋亡的影

8、響;Cyto-ID(@)綠色熒光染料流式細(xì)胞儀和激光共聚焦掃描顯微鏡分析細(xì)胞自噬水平變化;Western blot檢測4-HNE、HO-1、NQO1、GCLM、Nrf2、Bax、Bcl-2、Beclin1蛋白表達(dá)水平，從氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬等多條途徑探討SchB防治CsA腎毒性的可能機(jī)制，為臨床二藥聯(lián)用應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　結(jié)果:
　　1.建立全血樣品中CsA的LC/MS/MS分析方法，該方法采用多反應(yīng)監(jiān)測定量Cs

9、A原型藥物濃度，其結(jié)果不受CsA代謝物的影響。方法學(xué)考察的專屬性、線性范圍、基質(zhì)效應(yīng)、提取回收率、精密度、穩(wěn)定性均符合生物樣品檢測指導(dǎo)原則要求，適用于臨床上監(jiān)測CsA血藥濃度，指導(dǎo)臨床上CsA的合理使用劑量，進(jìn)而減少CsA的毒副作用的發(fā)生。
　　2.運(yùn)用建立的全血樣本中CsA的LC/MS/MS分析方法，考察了五味子提取物與CsA聯(lián)合用藥時(shí)對(duì)CsA在大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)的影響。結(jié)果表明:
　?、賳为?dú)給予25mg/kgCsA，其藥代動(dòng)

10、力學(xué)參數(shù)為:Cmax為2608±585.89ng/mL; Tmax為6.33±1.50h; t1/2為19.92±6.43h; AUC0→∞為82851.36±16615.30ng h/mL;
　　②單次灌服給予54mg/kg SCE后同時(shí)給藥25mg/kg CsA，其其Cmax為3456.674±251.89ng/mL; Tmax為6.8±1.10h;t1/2為29.66±14.27h;AUC0→∞為132564.2±50934

11、.74 ngh/mL;
　?、蹎未喂喾o予108mg/kg SCE后同時(shí)給藥25mg/kg CsA后，其Cmax為3026.806±409.61 ng/mL;Tmax為8.67±1.63h;t1/2為28.44±9.00h;AUC0→∞為114030.90±21573.65ngh/mL;
　　④單次灌服給予216mg/kg SCE后同時(shí)給藥25mg/kg CsA后，其Cmax為3286.45±1418.41 ng/mL; T

12、max為13.5±7.55 h; t1/2為34.94±12.67h;AUC0→∞為173777.70±95727.64;
　　以上結(jié)果說明，大鼠灌服不同濃度的SCE后，其藥動(dòng)參數(shù)與單獨(dú)給予CsA組相比較有明顯的提高或延長，提示CsA聯(lián)合五味子用藥時(shí)，五味子可改變CsA體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)行為，即聯(lián)合用藥時(shí)，可以通過減少CsA用量而仍達(dá)到治療濃度的目的，從而減少副作用和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
　　3.連續(xù)灌胃給藥28天后，與25mg/kg CsA

13、組相比較，SCE可以改善大鼠體重下降;降低血清中肌酐、尿素氮含量和腎臟組織中丙二醛水平;升高腎臟組織中的CAT和GSH-Px的活性;減輕CsA引起的腎小管萎縮壞死，炎癥細(xì)胞浸潤以及腎小管間質(zhì)纖維化，說明SCE可以有效的降低CsA引起的腎臟毒性。同時(shí)，SCE可以上調(diào)HO-1、Nrf2、P-gp蛋白表達(dá)，下調(diào)4-HNE、Bcl-2、Cleaved caspase3和LC3A/B蛋白表達(dá)，提示SCE可能是通過降低腎臟氧化應(yīng)激、凋亡因子、自噬水

14、平，繼而防治CsA致腎臟損傷。
　　4.HK-2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:①CsA以劑量-時(shí)間依賴性降低HK-2細(xì)胞存活率;當(dāng)給予不同濃度SchB(2.5、5.0、10.0μM)配伍10μM CsA干預(yù)處理HK-2細(xì)胞24h后，細(xì)胞的存活率明顯提高，乳酸脫氫酶(LDH)漏出率和細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平顯著降低;細(xì)胞內(nèi)還原性谷胱甘肽(GSH)提高;下調(diào)4-HNE蛋白表達(dá);說明SchB干預(yù)處理HK-2細(xì)胞，能顯著的抑制CsA引起氧化性損傷，

15、繼而保護(hù)細(xì)胞。②AnnexinⅤ-FITC/PI雙染結(jié)果顯示CsA以劑量-時(shí)間依賴性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;當(dāng)與10μM CsA組相比，用2.5、5.0、10.0μM SchB干預(yù)處理HK-2細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率分別顯著降低至18.12％、16.80％、15.25％;另一方面，SchB干預(yù)后，能顯著增加CsA引發(fā)的線粒體膜電位的下降;Western blot檢測Bax蛋白表達(dá)降低，Bcl-2蛋白表達(dá)升高;說明SchB干預(yù)處理保護(hù)CsA引起細(xì)胞凋亡有

16、可能通過線粒體調(diào)節(jié)內(nèi)源性途徑抑制細(xì)胞凋亡。③Cyto-ID(@)綠色染料單染顯示CsA以劑量-時(shí)間依賴性誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬;但當(dāng)給予SchB干預(yù)作用后，細(xì)胞的自噬的水平受到明顯的抑制;進(jìn)一步采用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察自噬溶酶體綠色熒光斑點(diǎn)聚集情況，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)CsA處理作用的HK-2細(xì)胞周圍存在強(qiáng)度明顯的綠色熒光斑點(diǎn)聚集，當(dāng)SchB干預(yù)后，明顯減少綠色斑點(diǎn)聚集，;同時(shí)觀察在SchB處理后，自噬標(biāo)記蛋白Beclin1表達(dá)下降，提示SchB處理

17、抑制CsA誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。④研究還發(fā)現(xiàn)，SchB干預(yù)處理，能顯著促進(jìn)Nrf2核轉(zhuǎn)位，并進(jìn)一步激活其下游Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶基因HO-1、NQO1、GCLM蛋白表達(dá)，提示說明SchB能通過激活Nrf2/ARE信號(hào)通路，防治CsA引起腎臟細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。
　　結(jié)論:
　　五味子木脂素可增加CsA在大鼠體內(nèi)的藥物濃度，并可防治CsA引發(fā)的腎臟毒性，其機(jī)制可能與降低ROS水平，穩(wěn)定線粒體膜，調(diào)控Nrf2通路發(fā)揮抗氧化作用;并通過線