褪黑素對(duì)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞甘氨酸電流的調(diào)制作用.pdf

1、褪黑素對(duì)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞甘氨酸電流的調(diào)制作用褪黑素(Melatonin，MEL)可由多種組織器官合成和分泌，廣泛分布于中樞及周圍組織，其分子式為C13H16N2O2，化學(xué)名稱為5.甲氧基-N-乙酰色胺，參與多種生理功能的調(diào)節(jié)，包括睡眠與覺醒、免疫、晝夜節(jié)律、體溫等等。它通過(guò)與特異性MEL受體結(jié)合發(fā)揮作用。目前已純化的脊椎動(dòng)物的MEL受體主要分為三種：MT1，MT2和MT3受體。雖然對(duì)MT3受體的特性還不甚了解，但MT1和MT2受體均

2、已證實(shí)為G蛋白耦聯(lián)受體，激活這兩種受體可經(jīng)G蛋白引起一系列第二信使級(jí)聯(lián)反應(yīng)，例如cAMP依賴性蛋白激酶(cAMP-dependent proteinkinase，PKA)、cGMP依賴性蛋白激酶(cGMP-dependent protein kinase，PKG)、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)等參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。 在脊椎動(dòng)物視網(wǎng)膜，MEL，可由光感受器獨(dú)立合成及釋放，并以旁分泌的方式到達(dá)視網(wǎng)膜各級(jí)神經(jīng)元

3、發(fā)揮神經(jīng)調(diào)制作用。已有研究工作證實(shí)，視網(wǎng)膜多種神經(jīng)元都表達(dá)特異性MEL受體，包括位于內(nèi)層視網(wǎng)膜的無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞(amacrine cell，AC)、內(nèi)網(wǎng)層(inner plexiform layer，IPL，)以及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。在本工作中，我們采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色、全細(xì)胞膜片鉗記錄，結(jié)合快速溶液切換裝置(RSC-100)和鈣成像技術(shù)，研究了MEL對(duì)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cell，RGC)的甘氨酸受體活動(dòng)的調(diào)制

4、。 熒光金逆行標(biāo)記RGC結(jié)合免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示，大部分RGC均表達(dá)MT2受體，所有RGC都不表達(dá)MTl受體。 MEL在部分RGC(33％)明顯增大由士的寧敏感的甘氨酸受體介導(dǎo)的電流，并具有時(shí)間依賴性，隨孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，增大作用越來(lái)越明顯，在孵育8-10 min左右時(shí)作用最大。MT2受體特異性拮抗劑4-P-PDOT 阻斷MEL的增大作用，提示MEL增大甘氨酸電流由MT2受體介導(dǎo)。我們的研究集中在這些RGC上。胞內(nèi)施加

5、G蛋白抑制劑GDP-β-S可阻斷MEL的作用，提示G蛋白介導(dǎo)了MT2受體激活后的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。cAMP和cGMP擬似物8.Br-cAMP和8-Br-cGMP對(duì)甘氨酸電流本身均無(wú)明顯影響，給予PKA抑制劑H-89或PKG抑制劑KT5823也不能阻斷MEt，增大甘氨酸電流的作用，提示cAMP及cGMP信號(hào)通路與MEL增大甘氨酸電流無(wú)關(guān)。另一方面，磷脂酰膽堿特異性磷脂酶C(phosphatidylcholine-specific phos

6、pholipase C，PC-PLC)抑制劑D609減小甘氨酸電流，預(yù)孵育D609可以完全阻斷MEL的作用，表明PC-PLC通路參與MEL對(duì)甘氨酸電流的調(diào)制作用。 我們進(jìn)一步探討了PKC信號(hào)通路是否參與了MEL的作用。PKC激活物PMA能時(shí)間依賴性地增大甘氨酸電流，與MEL類似。當(dāng)甘氨酸電流被MEL增大后，再孵育PMA不能再增大甘氨酸電流。另一方面，如果單獨(dú)用PKC抑制劑Bis IV孵育可減小甘氨酸電流，這一作用與MEL對(duì)甘氨

7、酸電流的作用正好相反。而在BisⅣ孵育的情況下，MEL增大甘氨酸電流的效應(yīng)被阻斷。上述結(jié)果強(qiáng)烈提示，PKC通路的激活作為PLC激活的后續(xù)作用，可能是MEL增大甘氨酸電流的重要環(huán)節(jié)。 目前為止，PKC分為兩種亞型，一種是鈣依賴性的，另一種是鈣非依賴性的。在本實(shí)驗(yàn)中，胞內(nèi)外無(wú)鈣環(huán)境對(duì)MEL的作用無(wú)明顯影響，提示參與MEL，調(diào)節(jié)作用的PKC屬于鈣非依賴性的。進(jìn)一步的鈣成像實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，孵育MEL對(duì)大鼠視網(wǎng)膜RGC的胞內(nèi)鈣離子濃度(in

8、tracellular calcium concentration，[ca2+]i)無(wú)明顯影響，這也為鈣離子不參與MEL增大甘氨酸電流的作用提供了部分依據(jù)。 本論文的結(jié)果證實(shí)，MEL通過(guò)激活RGC上的MT2受體增大甘氨酸電流，其胞內(nèi)機(jī)制可能涉及PC-PLC引起的相關(guān)反應(yīng)。由于甘氨酸受體的活動(dòng)在RGC感受野的形成和調(diào)節(jié)中起重要作用，因此MEL可能通過(guò)對(duì)RGC上甘氨酸電流的影響實(shí)現(xiàn)對(duì)大鼠內(nèi)層視網(wǎng)膜光信號(hào)整合過(guò)程的調(diào)制。此外，細(xì)胞內(nèi)