內(nèi)源性乙酰膽堿在小鼠肺泡液體清除中作用及其分子機制.pdf

1、臨床上多種原因可導致肺泡內(nèi)液體集聚過多，如:支氣管肺泡灌洗、淹溺、心功能不全、急性肺損傷等。目前已研究證實肺泡內(nèi)液體清除過程主要是由肺泡上皮細胞主動重吸收鈉，再由基底側(cè)細胞膜上鈉鉀ATP酶將其泵入到肺間質(zhì)，肺泡內(nèi)的水在滲透壓梯度作用下通過上皮細胞膜的水通道或單純擴散進入肺間質(zhì)，最后由淋巴管或毛細血管回吸收。肺泡液體清除率(alveolar Fluid clearance，AFC)與肺水腫之間關系密切，提高肺泡液體的清除率，可以加速肺泡內(nèi)

2、積聚的液體的清除，促進肺水腫液的回吸收，在此過程中，肺泡上皮細胞項膜上的鈉通道及基底膜上的鈉鉀ATP酶的功能狀態(tài)決定了肺泡上皮細胞的液體轉(zhuǎn)運能力。
　　鈉鉀ATP酶是廣泛存在于膜上的異二聚體跨膜離子轉(zhuǎn)運蛋白，在肺泡液體清除過程中，鈉鉀ATP酶的功能是形成細胞膜內(nèi)外滲透性梯度差，引起鈉離子順濃度差轉(zhuǎn)運，使3個鈉離子被轉(zhuǎn)運出細胞的同時泵入2個鉀離子。鈉鉀ATP酶在肺泡上皮細胞膜上表達增加或其活性增強能夠促進肺泡液體清除。相反，鈉鉀AT

3、P酶在肺泡上皮細胞膜上低表達或抑制其活性則導致肺泡液體清除率下降。因此鈉鉀ATP酶的功能是調(diào)節(jié)肺泡上皮功能的一個重要的和基礎的分子機制。
　　膽堿能神經(jīng)在肺組織內(nèi)廣泛分布，調(diào)節(jié)著氣道張力、血流供應、黏液分泌以及呼吸型式等，膽堿能M型和N型受體在人和鼠類肺泡上皮細胞上分布，自2000年以來多項研究采用迷走神經(jīng)切斷或電刺激迷走神經(jīng)方法研究膽堿能神經(jīng)在膿毒癥或非膿毒癥（機械通氣、缺血再灌注、油酸誘導等）急性肺損傷中的抗炎或抗凋亡作用。最

4、近膜片嵌技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)膽堿能受體激動劑卡巴膽堿和oxotremorine能夠劑量依賴性地激活大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞鈉電流，提示膽堿能受體參與調(diào)解了肺泡上皮的鈉離子轉(zhuǎn)運。臨床上在進行支氣管肺泡灌洗操作時，如果應用M膽堿能受體阻斷劑阿托品能夠增加肺泡液體回吸收量。推測膽堿能神經(jīng)可能參與調(diào)節(jié)肺泡液體轉(zhuǎn)運，但目前對于膽堿能神經(jīng)在肺泡液體清除中的作用尚未見國內(nèi)外報道，因此本研究采用了迷走神經(jīng)切斷、電刺激的方法以及外源性給予氯化乙酰膽堿研究了乙酰膽堿在

5、肺泡液體轉(zhuǎn)運中的作用，并進一步探討了氯化乙酰膽堿與肺泡上皮鈉鉀ATP酶的相互作用，具體內(nèi)容如下:
　　第一部分迷走神經(jīng)干預對小鼠肺泡液體清除作用的影響
　　目的:采用迷走神經(jīng)切斷或電刺激的方法觀察迷走神經(jīng)在肺泡液體轉(zhuǎn)運中的作用，進而證明內(nèi)源性乙酰膽堿參與調(diào)解了肺泡液體轉(zhuǎn)運。
　　方法:60只清潔雄性Balb/c小鼠，體重28-30g，隨機分為4組，每組15只，其中每組中6只用來測量肺泡液體清除率(AFC)，6只用來測定

6、血漿中乙酰膽堿的水平，3只用來行HE染色。①假手術(shù)對照組(Con):左側(cè)迷走神經(jīng)分離，但不處理干預。②左側(cè)迷走神經(jīng)切斷(LVAG):左側(cè)迷走神經(jīng)分離切斷。③左側(cè)迷走神經(jīng)外周端刺激(LVS1):左側(cè)迷走神經(jīng)分離切斷，電極刺激其外周端，即傳出神經(jīng)。④左側(cè)迷走神經(jīng)中樞端刺激(LVS2):左側(cè)迷走神經(jīng)分離切斷，電極刺激其中樞端，即傳入神經(jīng)。將含有Evans藍標記的5％白蛋白等滲生理鹽水溶液250ul以每2分鐘一次，每次50ul的速度注入小鼠的肺

7、泡腔內(nèi)，實驗20分鐘后頸動脈放血處死小鼠回吸收肺泡內(nèi)剩余液體，用酶標儀測量Evans藍標記的白蛋白濃度，根據(jù)注入前后白蛋白濃度的變化計算肺泡液體清除率，以觀察迷走神經(jīng)在肺泡液體轉(zhuǎn)運中的作用。因乙酰膽堿在血漿內(nèi)快速被代謝，我們收集迷走神經(jīng)干預即刻的血漿標本，用南京建成的試劑盒測量血漿乙酰膽堿的含量，從而間接反映迷走神經(jīng)干預影響了血漿乙酰膽堿水平。HE染色標本收集了灌注后30分鐘的組織標本，從形態(tài)學上觀察迷走神經(jīng)干預對肺泡液體清除過程的影響

8、。
　　結(jié)果:與正常對照組相比，左側(cè)迷走神經(jīng)切斷明顯降低了AFC(66.88±2.64％ VS48.69±2.57％; P＜0.01);與左側(cè)迷走神經(jīng)切斷組相比，左側(cè)迷走神經(jīng)外周端刺激明顯升高了AFC(48.69±2.57％ VS60.81±1.96％; P＜0.01);而左側(cè)迷走神經(jīng)中樞端刺激出現(xiàn)了更為降低的AFC(38.49±1.45％VS48.69±2.57％; P＜0.05)。與對照組血漿中的乙酰膽堿水平（4.64±0.2

9、5ug/ml）相比，左側(cè)迷走神經(jīng)切斷(3.59±0.27ug/ml)及左側(cè)迷走神經(jīng)中樞端刺激（2.98±0.18 ug/ml）血漿中的乙酰膽堿水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，而在迷走神經(jīng)外周端刺激組(6.01±0.54 ug/ml)明顯升高，且差異具有明顯統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。HE染色結(jié)果顯示對照組有輕度間質(zhì)水腫;單側(cè)迷走切斷組肺泡腔內(nèi)可見較多粉紅色灌注液，間質(zhì)水腫明顯;外周端刺激組相對于單側(cè)迷走切斷組間質(zhì)水腫減輕

10、。
　　結(jié)論:
　　1、單側(cè)迷走神經(jīng)切斷降低了AFC，提示迷走神經(jīng)參與調(diào)節(jié)了肺泡液體轉(zhuǎn)運。
　　2、電刺激迷走傳出神經(jīng)而非傳入神經(jīng)能夠逆轉(zhuǎn)降低的AFC，提示迷走神經(jīng)促進肺泡液體轉(zhuǎn)運是通過其傳出神經(jīng)發(fā)揮作用。
　　3、電刺激迷走神經(jīng)外周端明顯升高了血漿乙酰膽堿的水平，提示電刺激迷走神經(jīng)傳出段促進肺泡液體清除可能是通過其末梢釋放內(nèi)源性乙酰膽堿發(fā)揮作用。
　　第二部分氯化乙酰膽堿對肺泡液體清除率及肺組織鈉鉀ATP

11、酶的影響
　　目的:觀察外源性氯化乙酰膽堿對肺泡液體清除率及其肺組織勻漿鈉鉀ATP酶的影響
　　方法:昆明小鼠75只，隨機分為5組，每組15只，其中每組中6只用來測量肺泡液體清除率(AFC)，6只用來留取標本測量鈉鉀ATP酶活性及蛋白表達，其余3只留HE染色組織標本。①正常對照（control）。②10-4mol/L乙酰膽堿。③10-5mol/L乙酰膽堿。④10-6mol/L乙酰膽堿。⑤10-6mol/L乙酰膽堿+10-6m

12、ol/L阿托品。肺泡腔灌注液為Evans藍標記的5％白蛋白等滲生理鹽水內(nèi)加入上述各組不同濃度的藥物，將灌注液200ul以每次40ul，每2分鐘一次的速度注入昆明小鼠的肺泡內(nèi)，20分鐘后用100ul的微量進樣器回吸收肺泡內(nèi)殘余液體，用酶標儀測定Evans藍標記的白蛋白濃度，根據(jù)注入前后白蛋白濃度的變化計算肺泡液體清除率。肺組織灌注液調(diào)整為生理鹽水稀釋的不同濃度的氯化乙酰膽堿，收集肺組織標本以用來測定鈉鉀ATP酶的活性（南京建成的試劑盒）、

13、膜上Na，K-ATPα1蛋白(western blot)表達及HE染色。
　　結(jié)果:1與對照組相比，氯化乙酰膽堿劑量依賴性增加了AFC，10-4M氯化乙酰膽堿上調(diào)肺泡液體清除率達到較高值(42.95±2.41％vs57.93±3.21％ P≤0.01)。10-6M阿托品阻斷了10-6M氯化乙酰膽堿上調(diào)AFC的作用(45.17±1.05％ vs48.99±1.42％ P≤0.05)。2對照組Na，K-ATP酶的活性是3.69±0.1

14、9u/mgprot，在氯化乙酰膽堿刺激組其活性分別是10-4M Ach5.85±0.21 u/mgprot;10-5M Ach5.14±0.22 u/mgprot;10-6M Ach4.4±0.14 u/mgprot，10-4-10-6M氯化乙酰膽堿明顯增加了Na，K-ATP酶的活性(P＜0.05)，10-6M阿托品阻斷了10-6氯化乙酰膽堿對Na，K-ATP酶的作用(3.12±0.42 u/mgprot vs4.4±0.14 u/mg

15、prot P＜0.05)。3與正常對照組相比，乙酰膽堿刺激各組肺組織勻漿Na，K-ATPα1蛋白的表達沒有明顯差別(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、膽堿能神經(jīng)激動劑氯化乙酰膽堿能夠劑量依賴性增加肺泡液體清除率，阿托品能夠阻斷該效應。
　　2、氯化乙酰膽堿能夠增加肺組織勻漿Na，K-ATP酶的活性，阿托品同樣能夠阻斷該效應。
　　3、氯化乙酰膽堿刺激對肺組織勻漿上總Na，K-ATPα1的蛋白表達沒有影響。

16、r>　　第三部分氯化乙酰膽堿對A549細胞上Na，K-ATP酶的影響
　　目的:培養(yǎng)肺泡上皮A549細胞，觀察10-5M氯化乙酰膽堿刺激對該細胞膜上Na，K-ATP酶的活性及蛋白表達量的影響。
　　方法:A549接種至培養(yǎng)皿后，隨機分為正常對照組(Con)，氯化乙酰膽堿刺激組（10-5mol/L），氯化乙酰膽堿加阿托品阻斷組(10-5mol/LAch+10-5mol/L Atr)，分別觀察5分鐘、10分鐘，并用酶活性測定試劑

17、盒測量細胞上Na，K-ATP酶的活性，采用免疫熒光及western-blot方法觀察細胞膜上Na，K-ATP酶蛋白的表達。
　　結(jié)果:1與對照組相比，10-5M氯化乙酰膽堿刺激明顯增加了Na，K-ATPase的活性，5分鐘時（3.27±0.23 u/mgprot VS5.34±0.5 u/mgprotP＜0.01），10分鐘時（3.22±0.11 u/mgprot VS3.91±0.22 u/mgprotP＜0.05）。與氯化乙酰

18、膽堿刺激組相比，加入阿托品阻斷膽堿能M受體后，Na，K-ATPase的活性顯著下降，5分鐘（5.34±0.5 u/mgprot VS3.62±0.29 u/mgprot P＜0.01），10分鐘（3.91±0.22 u/mgprot VS3.27±0.16u/mgprot P＜0.05）。2免疫熒光結(jié)果顯示:與對照組相比，10-5M氯化乙酰膽堿刺激5分鐘細胞膜上Na，K-ATPase蛋白的綠色熒光未見明顯差別，細胞連接基底側(cè)細胞膜上可見

19、明顯的熒光積聚，提示用藥組基底側(cè)細胞膜上出現(xiàn)Na，K-ATPase蛋白積聚。3 western-blot結(jié)果顯示:以對照組灰度值相比，氯化乙酰膽堿刺激5分鐘明顯增加了基底側(cè)細胞膜上相對的Na，K-ATPaseα1蛋白含量，與刺激組灰度值相比，膽堿能M受體阻斷劑阿托品阻斷了氯化乙酰膽堿的作用。
　　結(jié)論:
　　1、氯化乙酰膽堿能夠增加A549細胞鈉鉀ATP酶在基底側(cè)細胞膜上的表達，同時增強其在膜上的活性。
　　2、氯化乙