小鼠卵巢玻璃化凍融過程FSH干預(yù)對卵泡存活及血管生成相關(guān)因子的影響.pdf

1、目的：卵巢的低溫保存成為女性生育力保持的一個有效策略,在癌癥治療后將之前凍/融卵巢組織移植回患者體內(nèi),從而恢復(fù)其卵巢功能,適合于兒童、青少年以及不能推遲癌癥治療的患者。目前,已有30多例健康嬰兒來自移植的冷凍卵巢組織,證明這項(xiàng)技術(shù)被成功地實(shí)施。盡管這項(xiàng)技術(shù)有一個好的應(yīng)用前景,但在卵巢移植后處在一個約48小時以上的缺血缺氧環(huán)境,導(dǎo)致大量卵泡的損失。我們的前期研究顯示在小鼠卵巢玻璃化凍融過程中添加FSH后回移的無血管吻合移植卵巢血流再通的時

2、間提前，生育能力提高，但相關(guān)機(jī)制尚不明了。故本研究目的是通過對小鼠卵巢玻璃化凍融過程中FSH的添加，探索FSH干預(yù)對解凍后卵巢無血管吻合移植前后的卵泡存活及血管重建相關(guān)因子的影響。
　　方法：將動情間期4周齡C57BL/6J小鼠卵巢隨機(jī)分為新鮮對照組（FCG）、玻璃化凍存對照組（VCG）和0.3IU/mLFSH干預(yù)玻璃化凍存組（FSH-VG）。玻璃化凍融后將半卵巢移植于6周齡C57BL/6J雌鼠腎被膜下，于移植前（解凍后）和移植后

3、48h對凍融卵巢內(nèi)各級卵泡計(jì)數(shù)；通過免疫組織化學(xué)觀察與血管生成及細(xì)胞存活相關(guān)的FSH-R、VEGF、Angpt-2、Kindlin-2、αvβ3、MMP-2、CD31、PCNA、Survivin在卵巢不同細(xì)胞中的定位；通過平均光密度（AOD）分析FSH-R、Angpt-2、Kingdlin-2在解凍后卵巢的表達(dá)量；通過Western-blot方法觀察并分析FSH干預(yù)對解凍后卵巢整合素αv、β3、VEGF、PCNA蛋白及對解凍后及移植后4

4、8h卵巢MMP-2、CD31、Survivin蛋白表達(dá)量的影響。
　　結(jié)果：在解凍后及移植后48h，F(xiàn)SH-VG與VCG組在卵泡、基質(zhì)細(xì)胞及纖維密度上較FCG組疏松，卵母細(xì)胞的完整性均不如FCG組，但與VCG相比，F(xiàn)SH-VG卵泡與基質(zhì)結(jié)構(gòu)排列整齊且較致密。無論是卵巢解凍后還是移植48h，原始卵泡、初級卵泡、正常卵泡及總卵泡數(shù)均為FSH-VG明顯高于VCG組，但低于FCG組P<0.05，閉鎖卵泡數(shù)為VCG組高于FCG及FSH-VG

5、組，P<0.05；卵泡存活相關(guān)因子PCNA和Survivin蛋白檢測顯示，PCNA蛋白主要表達(dá)于卵巢顆粒細(xì)胞及卵母細(xì)胞核中，Survivin主要表達(dá)于卵母細(xì)胞中，在解凍后PCNA及Survivin Western-blot結(jié)果顯示FSH-VG優(yōu)于VCG組（P<0.05），但兩組均低于FCG組；移植后48h Survivin蛋白表達(dá)量為FSH-VG與FCG之間沒有明顯差異，而VCG組低于FCG組。FSH-R主要分布于卵巢的卵泡顆粒細(xì)胞中，

6、通過平均光密度(average optical density,AOD)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，解凍后FSH-VG組與VCG組FSH-R表達(dá)量均均低于FCG組（P<0.05），但FSH-VG組的表達(dá)量高于VCG組,P<0.05；促血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂的VEGF蛋白主要定位于卵泡膜及間質(zhì)中，解凍后的Western-blot統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示VCG組與FSH-VG組VEGF蛋白表達(dá)量均低于FCG組,P<0.05，但FSH-VG組高于VCG組,P<0.05；An

7、gpt-2免疫組化結(jié)果顯示主要表達(dá)于顆粒細(xì)胞、卵母細(xì)胞，AOD統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示解凍后FSH-VG組與VCG組Angpt-2表達(dá)量低于FCG組,P<0.05，但FSH-VG組Angpt-2表達(dá)量高于VCG組,P<0.01；Kindlin-2主要表達(dá)于顆粒細(xì)胞及卵母細(xì)胞，AOD統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示解凍后FSH-VG組Kindlin-2表達(dá)量與FCG組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，F(xiàn)CG與FSH-VG均高于VCG組（P<0.01、p<0.05）；整合素αvβ3幾乎表

8、達(dá)在卵巢所有細(xì)胞上。解凍后的Integrinαv Western-blot結(jié)果顯示其表達(dá)在三組間沒有明顯差異，P>0.05。而Integrinβ3Western-blot結(jié)果顯示FCG與FSH-VG組表達(dá)量均高于VCG組（P<0.05），F(xiàn)CG與FSH-VG之間沒有明顯差異；MMP-2其主要定位卵巢顆粒細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），Western-blot結(jié)果顯示MMP-2蛋白在解凍后三組之間沒有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而在移植后48h FSH

9、-VG組與FCG組之間沒有明顯差異，VCG組MMP-2蛋白表達(dá)量低于FCG組，P<0.05；CD31其主要定位于成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞，Western-blot結(jié)果顯示在解凍后三組之間沒有明顯差異，而在移植后48h FSH-VG組與FCG組之間沒有明顯差異，VCG組CD31蛋白表達(dá)量低于FCG組，P<0.05。
　　結(jié)論：1.小鼠卵巢玻璃化凍融過程中添加0.3IUmL-1FSH可以上調(diào)解凍后FSH-R、上調(diào)與血管生成相關(guān)因子VEGF、A