擬南芥CBF3等位基因AtCRAP2的克隆及抗寒功能研究.pdf

1、低溫是影響農(nóng)作物產(chǎn)量的主要限制因子之一。本實(shí)驗(yàn)室以擬南芥32個(gè)核心生態(tài)型為試材，在研究擬南芥CBF,瑾因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)抗寒生態(tài)型203AV的CBF：薛位基因的單倍性(haplotype)與擬南芥的抗寒性密切相關(guān)。本試驗(yàn)就以擬南芥203AV生態(tài)型為材料，克隆了CBF3等位基因，對(duì)其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析，并進(jìn)一步進(jìn)行了功能研究。主要結(jié)果如下： 1、克隆了基因AtCRAP2(DQ415923)，由1094對(duì)堿基組成

2、，推測(cè)編碼了含有150個(gè)氨基酸殘基的多肽。AtCRAP2與Columbia生態(tài)型186AV的CBF3基因相比，其一堿基發(fā)生突變，導(dǎo)致終止密碼子提前198bp，從而使這基因翻譯的蛋白少了66個(gè)氨基酸，致使這個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域缺失一部分。 2、以CBF3為對(duì)照，利用表達(dá)載體pGreen0029和組成性啟動(dòng)子CaMV35S啟動(dòng)子構(gòu)建AtCRAP2的植物表達(dá)載體，經(jīng)酶切驗(yàn)證正確后，采用農(nóng)桿菌花粉浸蘸的方法把它們轉(zhuǎn)．化到擬南Colum

3、bia生態(tài)型186AV中?？股睾Y選和PCR檢測(cè)證明得到轉(zhuǎn)基因植株。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株后代進(jìn)行卡那霉素抗性篩選等遺傳分析，在T2代獲得單位點(diǎn)插入的轉(zhuǎn)基因純系植株，并收獲了T3代種子。 3.與野生型相比，轉(zhuǎn)AtCRAP2基因擬南芥植株表型無(wú)明顯變化；而轉(zhuǎn)CBF3基因擬南芥出現(xiàn)明顯的表型變化，主要有生長(zhǎng)遲滯、鮮重減少、植株矮化等。在直接觀察中發(fā)現(xiàn)，4葉期時(shí)轉(zhuǎn)AtCRAP2基因擬南芥植株的根長(zhǎng)為3.70cm，野生型的根長(zhǎng)為3.75cm，均

4、明顯長(zhǎng)于轉(zhuǎn)CBF3瑾因的擬南芥植株的2.75cm；12葉期，稱量轉(zhuǎn)AtCRAP2基因擬南芥植株三棵的總重量為0.26g，野生型的為0.27g，明顯重于轉(zhuǎn)CBF3基因的擬南芥植株的0.13g；轉(zhuǎn)AtCRAP2基因擬南芥植株的開(kāi)花時(shí)間與野生型的接近，而轉(zhuǎn)CBF3基因擬南芥則滯后12天左右。進(jìn)一步利用微分干涉顯微鏡觀察了轉(zhuǎn)基因植株葉片下表皮細(xì)胞的大小，轉(zhuǎn)AtCRAP2基因擬南芥植株葉片的下表皮細(xì)胞與野生型葉片的無(wú)明顯差異；而轉(zhuǎn)CBF3基因擬南

5、芥植株葉片的下表皮細(xì)胞明顯小于野生型和轉(zhuǎn)AtCRAP2基因擬南芥植株的下表皮細(xì)胞。 4.對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行抗凍性檢測(cè)，無(wú)論低溫馴化與否，-6℃處理4小時(shí)后，轉(zhuǎn)AtCRAP2基因植株的相對(duì)外滲電導(dǎo)率為49±14﹪，明顯低于野生型的66±23﹪。-6℃處理6小時(shí)后，轉(zhuǎn)AtCRAP2基因植株的成活率為94﹪，明顯高于野生型的17﹪；而與轉(zhuǎn)CBF3基因的擬南芥植株相比，轉(zhuǎn)AtCRAP2基因植株的成活率無(wú)顯著差異。 5．采用R