不同來(lái)源細(xì)菌中floR基因的流行分布及其傳播機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　本文主要通過(guò)研究浙江溫州地區(qū)不同動(dòng)物源（包括魚、牛、兔、雞、鴨、鵝）和周圍環(huán)境（包括土壤、池水、養(yǎng)殖場(chǎng)排出的污水）來(lái)源的細(xì)菌對(duì)氟苯尼考的耐藥性，了解氟苯尼考抗性基因floR在不同來(lái)源細(xì)菌中的分布情況，探討floR基因相關(guān)可移動(dòng)DNA元件的結(jié)構(gòu)及其水平傳播機(jī)制，為耐藥性的形成和傳播提供有效防治依據(jù)，為獸醫(yī)治療和新藥開(kāi)發(fā)提供參考。
　　方法：
　　1.從浙江溫州地區(qū)不同養(yǎng)殖場(chǎng)采集牛、兔、雞、鴨、鵝的新鮮糞便樣本

2、，魚腸道樣本及周圍環(huán)境中土壤、池水、養(yǎng)殖場(chǎng)排出的污水樣本，將不同來(lái)源的樣本稀釋后分別在LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布培養(yǎng)，挑取單個(gè)菌落對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分離純化；
　　2.對(duì)分離純化好的細(xì)菌做生化鑒定，提取細(xì)菌基因組進(jìn)行16s rRNA基因測(cè)序鑒定，確定細(xì)菌種屬；
　　3.采用瓊脂稀釋法對(duì)不同來(lái)源細(xì)菌進(jìn)行氟苯尼考、氯霉素、四環(huán)素、頭孢噻呋鈉、恩諾沙星5種抗生素的藥物敏感性試驗(yàn)，分析不同來(lái)源細(xì)菌的耐藥情況；
　　4.以細(xì)菌基因組為模板

3、，通過(guò)PCR擴(kuò)增篩查細(xì)菌中floR陽(yáng)性菌株，PCR產(chǎn)物通過(guò)測(cè)序后與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)確定floR基因陽(yáng)性菌株，了解不同來(lái)源細(xì)菌中floR基因的分布情況；
　　5.選取牛、雞、鵝來(lái)源的floR陽(yáng)性大腸埃希菌進(jìn)行脈沖場(chǎng)電泳，分析floR陽(yáng)性大腸埃希菌株間的同源性，了解本地區(qū)克隆傳播現(xiàn)象；
　　6.根據(jù)藥敏結(jié)果，選取43株 floR基因陽(yáng)性、對(duì)氟苯尼考高度耐藥（MIC≥512μg/ml）且含有質(zhì)粒的菌株進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn)，并對(duì)接合子

4、進(jìn)行鑒定，提取質(zhì)粒，用PCR驗(yàn)證質(zhì)粒是否攜帶floR基因，同時(shí)用瓊脂稀釋法檢測(cè)接合子對(duì)氟苯尼考和氯霉素的藥物敏感性，分析floR基因的水平轉(zhuǎn)移能力；
　　7.挑取一株鵝來(lái)源的大腸埃希菌和土壤來(lái)源的大腸埃希菌，分別提取基因組進(jìn)行全基因組測(cè)序，定位floR基因，分析其側(cè)翼區(qū)域及相關(guān)可移動(dòng)元件。
　　結(jié)果：
　　1.本次實(shí)驗(yàn)從溫州地區(qū)不同養(yǎng)殖場(chǎng)及周圍環(huán)境中共分離培養(yǎng)得到337株細(xì)菌，其中魚來(lái)源細(xì)菌53株，兔來(lái)源細(xì)菌62株，牛

5、來(lái)源細(xì)菌46株，雞來(lái)源細(xì)菌41株，鴨來(lái)源細(xì)菌28株，鵝來(lái)源細(xì)菌38株，土壤來(lái)源細(xì)菌27株，池水來(lái)源細(xì)菌20株，污水來(lái)源細(xì)菌23株。
　　2.經(jīng)過(guò)生化鑒定和16s rRNA基因測(cè)序鑒定，337株不同來(lái)源細(xì)菌中，以腸桿菌科細(xì)菌為主，有296株，占細(xì)菌總數(shù)的87.83％，其中以埃希菌屬中的大腸埃希菌最多見(jiàn)，有186株，占腸桿菌科細(xì)菌的62.84%，占總細(xì)菌數(shù)的55.19%。
　　3.不同來(lái)源的細(xì)菌對(duì)各種抗生素的耐藥情況不同，296

6、株腸桿菌科細(xì)菌對(duì)氯霉素耐藥的菌株有136株，耐藥率為45.95%，氟苯尼考低敏感（MICs≥32μg/ml）菌株有139株，占46.96%。
　　4.在296株腸桿菌科細(xì)菌中，有126株攜帶floR基因，陽(yáng)性率為45.57%。floR基因陽(yáng)性菌株都對(duì)氟苯尼考表現(xiàn)出一定程度的耐藥性。
　　5.對(duì)牛、雞和鵝來(lái)源的42株floR基因陽(yáng)性大腸埃希菌進(jìn)行脈沖場(chǎng)凝膠電泳，大部分條帶分子量在20～700 kb，條帶數(shù)目在5～28條左右，可

7、以分為39個(gè)PFGE型，有三對(duì)菌株相似度比較高。
　　6.對(duì)43株攜帶質(zhì)粒的floR基因陽(yáng)性菌株進(jìn)行肉湯法接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn)，成功獲得 floR基因陽(yáng)性接合子8株。
　　7.全基因組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)鵝來(lái)源的大腸埃希菌攜帶的floR基因結(jié)構(gòu)與本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)測(cè)序的肺炎克雷伯菌 FK1341的結(jié)構(gòu)相似，上、下游都有 TnpA轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)，而土壤來(lái)源的大腸埃希菌則略有不同。
　　結(jié)論：
　　1.在不同樣本分離得到的細(xì)菌中，以腸桿菌科細(xì)

8、菌為主，占細(xì)菌總數(shù)的87.83%，是各種樣本中普遍存在的細(xì)菌，通過(guò)對(duì)其耐藥性分析可以反映農(nóng)場(chǎng)中細(xì)菌耐藥性發(fā)生情況。
　　2.不同來(lái)源的細(xì)菌對(duì)各種抗生素的耐藥情況不同，其中鵝來(lái)源的耐藥率最高，可能與抗生素使用頻率有關(guān)。并且在水和土壤中也檢出了氟苯尼考低敏感性菌株，可能是由于近些年氟苯尼考在畜禽養(yǎng)殖業(yè)廣泛應(yīng)用使其在環(huán)境中不斷的積累造成。
　　3. floR基因是最常見(jiàn)的氟苯尼考抗性基因，在氟苯尼考低敏感性的139株細(xì)菌中，有12

9、6株攜帶floR基因，13株未檢測(cè)到floR基因，可能含有其他氟苯尼考抗性基因。
　　4.大腸埃希菌之間存在相似度高的菌株，表明floR陽(yáng)性大腸埃希菌在本地的動(dòng)物之間可能發(fā)生了克隆傳播的現(xiàn)象。
　　5.接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn)成功說(shuō)明floR基因可以隨著其所在質(zhì)粒在不同種屬細(xì)菌之間發(fā)生水平轉(zhuǎn)移。另外，本研究中測(cè)序分析的大腸埃希菌floR基因側(cè)翼區(qū)域具有轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)和其他耐藥基因，基因環(huán)境結(jié)構(gòu)復(fù)雜，floR基因可能通過(guò)可移動(dòng)DNA元件發(fā)生轉(zhuǎn)