細(xì)胞核分離基因C與MEKK3相互作用的研究.pdf

1、細(xì)胞核分離基因C(Nuclear distribution gene C,NudC)的表達(dá)產(chǎn)物NudC在真核生物的細(xì)胞分裂過程中起著關(guān)鍵作用,它在物種進(jìn)化中保持了高度的保守性,其在果蠅、線蟲、小鼠、人中均有表達(dá)。NudC與細(xì)胞的分裂、增殖、血細(xì)胞生成和腫瘤發(fā)生關(guān)系非常密切。NudC蛋白在細(xì)胞中發(fā)揮功能是被高度調(diào)控的,Polo樣激酶1(Polo-like kinase1,PLK1)是目前發(fā)現(xiàn)的NudC的唯一上游調(diào)控激酶。我們利用免疫共沉淀

2、偶聯(lián)質(zhì)譜技術(shù),篩選出與一系列與NudC相互作用的蛋白分子,其中包括MEKK3。MEKK3(MAPK/ERK kinase kinase3,即mitogen-activated protein kinase kinase kinase3)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,激活后參與絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號途徑,與細(xì)胞周期調(diào)控、腫瘤發(fā)生、炎癥反應(yīng)和心血管疾病等相關(guān)。本課

3、題就是要驗證MEKK3和NudC之間相互作用的真實性以及探討MEKK3是否為NudC的一個上游調(diào)控激酶。我們首先利用RT-PCR方法從人類腎臟胚胎細(xì)胞中擴(kuò)增出MEKK3的cDNA片段,并將其分別克隆到帶有FLAG標(biāo)簽的真核表達(dá)載體pCMV-tag-2c和帶有GFP融和蛋白的真核表達(dá)載體pEGFP-C1中,構(gòu)建野生型MEKK3的真核表達(dá)重組質(zhì)粒FLAG-MEKK3 WT(WT即wide type,野生型)和GFP-MEKK3(GFP-ME

4、KK3WT)。然后,我們應(yīng)用重疊延伸PCR定點突變技術(shù)從質(zhì)粒FLAG-MEKK3 WT中擴(kuò)增激酶活性失活型的MEKK3 KD(MEKK3 Kinase dead,K391M),并將其克隆到帶有FLAG序列標(biāo)簽的真核表達(dá)載體pCMV-tag-2c中,構(gòu)建激酶活性喪失突變體FLAG-MEKK3 KD。我們將前期工作中已經(jīng)擴(kuò)增出的NudC的基因片斷,連入真核表達(dá)載體pCMV-tag-2c和pEGFP-C1及攜帶GST融和蛋白的原核表達(dá)載體pG

5、EX-5X-1中,構(gòu)建了重組質(zhì)粒FLAG-NudC、GFP-NudC和GST-NudC。然后,我們將構(gòu)建的所有真核表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HeLa細(xì)胞中,檢測其異源表達(dá)效率,發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量均比較高。將重組質(zhì)粒GST-NudC轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,誘導(dǎo)表達(dá)并成功的純化了GST-NudC融合蛋白。在此基礎(chǔ)上,我們通過GST-Pull down技術(shù),體外驗證了MEKK3確實可以和NudC相互作用。我們將重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)到真核細(xì)胞HeLa中,應(yīng)用免疫共沉淀

6、技術(shù)證明MEKK3和NudC在體內(nèi)也存在相互作用。隨后,我們又利用體外模擬磷酸化實驗證明,野生型FLAG-MEKK3 WT在體外可以磷酸化NudC,而激酶活性喪失突變體FLAG-MEKK3 KD無法將其磷酸化。磷酸化反應(yīng)后的GST-NudC經(jīng)小牛堿性磷酸酶CIP(Calf Intestinal Alkaline Phosphatase)處理后,磷酸化條帶消失,進(jìn)一步證實了MEKK3能體外磷酸化NudC。激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),當(dāng)MEK