淫羊藿苷及淫羊藿素通過(guò)GPER和IGF-1R抑制小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、帕金森病（Parkinson's Disease，PD）以黑質(zhì)致密帶（substantia nigra par compacta, SNpc）多巴胺能神經(jīng)元的進(jìn)行性變性、缺失為主要病變。越來(lái)越多的研究證明神經(jīng)炎癥在PD的發(fā)病中起著重要作用。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）內(nèi)的重要免疫感受效應(yīng)細(xì)胞，研究指出多巴胺能神經(jīng)元易受炎癥侵襲的影響，PD患者的PET影像結(jié)果顯示小膠質(zhì)細(xì)胞的活化與多巴胺

2、能神經(jīng)元的喪失平行發(fā)生，提示炎癥反應(yīng)和PD的發(fā)病密切相關(guān)。因此通過(guò)藥物的抗炎作用，保護(hù)中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元，延緩PD的進(jìn)展，成為PD治療的新策略。
　　淫羊藿苷（icariin，ICA）是從淫羊藿中分離提取的黃酮類化合物，是淫羊藿的主要活性成分。研究顯示，口服ICA后，經(jīng)消化道內(nèi)腸道菌群的水解反應(yīng)，可生成淫羊藿素（icaritin，ICT）。文獻(xiàn)報(bào)道，ICA有神經(jīng)保護(hù)作用，能夠改善老年大鼠的認(rèn)知障礙，激活海馬靜止?fàn)顟B(tài)的神經(jīng)干細(xì)胞

3、。ICA可以抑制原代培養(yǎng)下丘腦神經(jīng)元的凋亡。此外，ICA具有明顯的抗炎作用。Zeng KW等報(bào)道，ICA能通過(guò)抑制 TAK1/IKK/NF-κB和JNK/p38 MAPK信號(hào)途徑，對(duì)抗脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）對(duì)原代培養(yǎng)的皮層小膠質(zhì)細(xì)胞的激活作用。但在帕金森病炎癥模型，ICA是否能夠?qū)寡仔砸蜃訉?duì)中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的損傷及其詳細(xì)的抗炎機(jī)制，目前研究較少。近年來(lái)的研究顯示，ICT作為ICA的水解衍生物，屬于

4、植物雌激素，具有類雌激素樣作用，能發(fā)揮雌激素樣的神經(jīng)保護(hù)作用和抗炎作用。但I(xiàn)CA和ICT是通過(guò)何種細(xì)胞膜靶蛋白發(fā)揮其抗炎作用，目前仍然不明確。G蛋白偶聯(lián)雌激素受體（G protein-coupled estrogen receptor，GPER）是7次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體家族中的一員。研究表明，雌激素的抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用與GPER介導(dǎo)的快速非基因組效應(yīng)密切相關(guān)。雌激素與GPER結(jié)合后，通過(guò)G蛋白，激活腺苷酸環(huán)化酶、磷脂酶C及生長(zhǎng)因子受體等

5、信號(hào)途徑，快速調(diào)控細(xì)胞的功能活動(dòng)，發(fā)揮其生物學(xué)作用。研究報(bào)道，在黑質(zhì)和紋狀體 GPER廣泛表達(dá)，而且雌激素對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用與GPER關(guān)系密切。Ma HR等報(bào)道，ICA、ICT可通過(guò)GPER、表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）介導(dǎo)的絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路刺激乳腺癌細(xì)胞SKBr3細(xì)胞的增生。

6、我們課題組前期的工作證實(shí)ICT可通過(guò)胰島素樣生長(zhǎng)因子-1受體（insulin-like growth factor-I receptor，IGF-1R）信號(hào)途徑對(duì)抗神經(jīng)毒素1-甲基-4苯基-吡啶離子（1-methyl-4-phenylpyridinium ion，MPP+）對(duì)多巴胺能神經(jīng)元MES23.5細(xì)胞的損傷。應(yīng)用神經(jīng)毒素1-甲基-4-苯基-1,2,3,6四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahyd

7、ropyridine，MPTP）制備的PD小鼠模型，證明ICA能夠?qū)股窠?jīng)毒素MPTP對(duì)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的損傷，其作用機(jī)制可能與MEK/ERK與PI3K/Akt信號(hào)通路的激活有關(guān)。鑒于以上研究背景，我們提出ICA、ICT是否通過(guò)GPER與IGF-1R介導(dǎo)的信號(hào)途徑發(fā)揮抗炎的神經(jīng)保護(hù)作用？我們研究的第一部分通過(guò)LPS作用于BV2小膠質(zhì)細(xì)胞建立炎癥模型，從離體細(xì)胞水平探討GPER和IGF-1R在ICA、ICT抗炎機(jī)制中所發(fā)揮的作用。第二部

8、分通過(guò)黑質(zhì)內(nèi)單側(cè)注射LPS建立去卵巢大鼠PD炎癥模型，從整體水平進(jìn)一步探討ICA能否通過(guò)GPER和IGF-1R抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)從而保護(hù)DA能神經(jīng)元。
　　1.淫羊藿苷（ICA）及淫羊藿素（ICT）通過(guò)GPER和IGF-1R抑制BV2小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究
　　LPS建立BV2小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥模型，應(yīng)用GPER阻斷劑G15或IGF-1R阻斷劑JB-1與ICA或ICT共同處理細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫印跡技術(shù)

9、，探究ICA和ICT通過(guò)GPER和IGF-1R發(fā)揮抗炎作用的機(jī)制。結(jié)果如下：
　?。?）LPS組炎性因子TNF-α、IL-1β、COX-2和iNOS的mRNA表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）。不同濃度的ICA（1,10,20,50μM）、ICT（1,10,20,50μM）預(yù)保護(hù)，能不同程度地抑制以上炎性因子的基因表達(dá)，其中10μM和20μM的ICA和ICT作用最明顯（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，我們

10、選用10μM的ICA和ICT。
　?。?）GPER阻斷劑G15能阻斷ICA、ICT在基因水平對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎性因子TNF-α、IL-1β、COX-2和iNOS表達(dá)的抑制作用（P＜0.05，P＜0.01）。
　?。?） IGF-1R阻斷劑JB-1亦能阻斷ICA、ICT在基因水平對(duì)LPS誘導(dǎo)的抑制炎性因子TNF-α、IL-1β、COX-2和iNOS表達(dá)的作用（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。
　?。?）ICA

11、及ICT能明顯抑制LPS誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞COX-2和iNOS蛋白表達(dá)的增加（P＜0.01，P＜0.001），此作用可被G15或JB-1所阻斷（P＜0.05，P＜0.001）。
　　（5）LPS組MAPKs蛋白（ERK、p38、JNK）的磷酸化水平明顯增加（P＜0.05，P＜0.01）；ICA、ICT能不同程度地抑制LPS誘導(dǎo)的MAPKs蛋白的磷酸化水平（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）；G15或JB-1可阻斷IC

12、A、ICT的保護(hù)作用（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。
　?。?）LPS組IκB蛋白的磷酸化水平亦明顯增加（P＜0.05，P＜0.01）； ICA、ICT能明顯抑制LPS誘導(dǎo)的IκB蛋白的磷酸化水平（P＜0.01，P＜0.001）；此保護(hù)作用可被G15或JB-1所阻斷（P＜0.01）。
　　上述結(jié)果提示，ICA、ICT能夠通過(guò)GPER和IGF-1R介導(dǎo)的信號(hào)通路抑制BV2小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。
　　2.淫

13、羊藿苷（ICA）通過(guò)GPER和IGF-1R抑制大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)保護(hù)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的機(jī)制研究
　　采用黑質(zhì)內(nèi)單側(cè)注射LPS建立去卵巢大鼠PD炎癥模型，灌胃給予ICA（10mg/kg），通過(guò)腹腔注射阿撲嗎啡（apomorphine，APO）誘導(dǎo)大鼠的旋轉(zhuǎn)行為。采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）、實(shí)時(shí)PCR、免疫印記等多種評(píng)價(jià)方法，系統(tǒng)探討了ICA通過(guò)抑

14、制炎癥反應(yīng)保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元的分子機(jī)制。結(jié)果如下：
　　（1）旋轉(zhuǎn)行為：LPS炎癥模型組，APO誘導(dǎo)的大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)較對(duì)照組明顯增加（P＜0.001）；ICA（10 mg/kg）給藥保護(hù)組的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)與LPS組相比明顯減少（P＜0.001），此作用可被GPER阻斷劑G15或IGF-1R阻斷劑JB-1所阻斷（P＜0.001）。ICA單用組大鼠無(wú)明顯的旋轉(zhuǎn)行為。
　?。?）HPLC結(jié)果顯示，損傷側(cè)LPS組紋狀體（striatum，S

15、tr）內(nèi)的多巴胺（dopamine，DA）及其代謝產(chǎn)物高香草酸（homovanillic acid，HVA）、二羥基苯乙酸（dihydroxyphenylacetic acid，DOPAC）含量比對(duì)照組含量明顯減少（P＜0.001）；ICA給藥組大鼠損傷側(cè)Str內(nèi)的DA、DOPAC和HVA均明顯增高，與LPS組相比具有顯著差異（P＜0.05，P＜0.01），G15或JB-1可阻斷此作用（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。IC

16、A單用組DA、DOPAC和HVA的含量與對(duì)照組沒(méi)有差異。
　?。?）單側(cè)黑質(zhì)注射LPS導(dǎo)致?lián)p傷側(cè)黑質(zhì)內(nèi)TH免疫陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目較未損傷側(cè)明顯減少，存活率只有未損傷側(cè)的37%；損傷側(cè)TH蛋白的表達(dá)也較對(duì)照組明顯減少（P＜0.01，P＜0.001）；ICA給藥組大鼠損傷側(cè) TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目及 TH蛋白的表達(dá)均明顯高于LPS組損傷側(cè)（P＜0.05，P＜0.01），TH陽(yáng)性神經(jīng)元存活率均超過(guò)60%，此作用可被G15或JB-1阻斷（P＜0.

17、05，P＜0.01）。ICA單用組TH免疫陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目和TH蛋白表達(dá)與對(duì)照組沒(méi)有差異。
　?。?）免疫組化結(jié)果顯示LPS組損傷側(cè)黑質(zhì)內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)過(guò)度激活態(tài)，并且數(shù)目明顯增多；給予ICA保護(hù)后，能明顯抑制損傷側(cè)黑質(zhì)內(nèi)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目及激活程度，此作用可被G15或JB-1阻斷。ICA單用組小膠質(zhì)細(xì)胞沒(méi)有明顯的激活。
　?。?）實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，LPS組黑質(zhì)內(nèi)IL-1β、TNF-α和iNOS mRNA的表達(dá)水

18、平明顯高于對(duì)照組（P＜0.001）；而ICA給藥組炎性因子的mRNA表達(dá)水平則明顯降低（P＜0.01，P＜0.001）；上述ICA的保護(hù)作用可以被G15或JB-1所阻斷（P＜0.05，P＜0.01）。ICA單用組黑質(zhì)內(nèi)IL-1β、TNF-α和iNOS mRNA表達(dá)與對(duì)照組沒(méi)有差異。（6）LPS組黑質(zhì)內(nèi)的COX-2和iNOS蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（P＜0.01）；ICA能明顯抑制LPS組COX-2和iNOS蛋白表達(dá)的增加（P＜0.05

19、，P＜0.001），此作用可被GPER阻斷劑G15或IGF-1R阻斷劑JB-1所阻斷（P＜0.05，P＜0.01）。ICA單用組黑質(zhì)內(nèi)COX-2和iNOS蛋白表達(dá)與對(duì)照組沒(méi)有差異。
　　（7）LPS組損傷側(cè)黑質(zhì)內(nèi)ERK、P38及JNK的磷酸化水平明顯高于對(duì)照組（P＜0.05，P＜0.01）；而ICA+LPS組上述蛋白的磷酸化水平則被明顯抑制（P＜0.05，P＜0.01），此作用可被G15或JB-1所阻斷（P＜0.05）。
　

20、?。?）LPS組損傷側(cè)黑質(zhì)內(nèi) IGF-1R表達(dá)明顯低于對(duì)照組（P＜0.01）；而 ICA+LPS組IGF-1R的表達(dá)與LPS組相比明顯上調(diào)（P＜0.01），G15或JB-1可阻斷ICA的保護(hù)作用（P＜0.05）。
　　以上結(jié)果提示，ICA可通過(guò)GPER、IGF-1R信號(hào)途徑抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，減輕其對(duì)黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的損傷。
　　結(jié)論：在離體細(xì)胞水平，ICA、ICT能夠?qū)筁PS誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。在整體