擬南芥氨基脫氧分支酸裂解酶的生物學(xué)功能研究.pdf

1、葉酸是指四氫葉酸及其衍生物這一類物質(zhì)，是介導(dǎo)一碳單位轉(zhuǎn)移的重要輔助因子，參與生物體內(nèi)許多重要反應(yīng)。葉酸分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)由三部分組成：喋啶、對(duì)氨基苯甲酸(pABA)和谷氨酸鹽。植物中葉酸的合成過程涉及兩個(gè)分支：pABA分支和喋啶分支。氨基脫氧分支酸裂解酶(ADCL)在pABA分支中催化氨基脫氧分支酸(ADC)芳香化為pABA。本論文是以突變體Atadcl為材料，分別用基因突變、RNAi、超表達(dá)和原核表達(dá)的方法來探討擬南芥中氨基脫氧分支酸裂解

2、酶(AtADCL)的生物學(xué)功能。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.基因AtADCL在擬南芥生長(zhǎng)的各個(gè)時(shí)期、各個(gè)組織中普遍表達(dá)。我們從ABRC訂購(gòu)了T-DNA插入突變體SALK111981。經(jīng)PCR鑒定得到了AtADCL的純合突變體，命名為Atadcl，并分析了基因AtADCL的轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況。當(dāng)采用跨T-DNA插入位點(diǎn)的基因特異性引物時(shí)突變體Atadcl中該基因的轉(zhuǎn)錄本幾乎檢測(cè)不到；當(dāng)采用不跨T-DNA插入位點(diǎn)的基因特異性引物時(shí)

3、突變體中的轉(zhuǎn)錄本豐度與野生型相比明顯下降。突變體Atadcl在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)階段與野生型并無明顯差異。統(tǒng)計(jì)了不同發(fā)育時(shí)期的蓮座葉葉片數(shù)目，發(fā)現(xiàn)突變體與野生型的蓮座葉葉片數(shù)目沒有差異。在黑暗誘導(dǎo)離體葉片凋亡的過程中，突變體與野生型的葉片凋亡速率無明顯差異。生長(zhǎng)在正常1/2MS和氮限制培養(yǎng)基上的突變體幼苗的狀態(tài)均比野生型好，而且，RT-PCR分析顯示參與氮代謝途徑中的某些基因在突變體中的轉(zhuǎn)錄本豐度比同樣條件下的野生型中的高。通過微生物法

4、檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)突變體中的總?cè)~酸含量是野生型的134.6％。另外，HPLC-MS/MS分析結(jié)果顯示突變體中的四氫葉酸含量是野生型的179.3％，5-甲基-四氫葉酸含量是野生型的125.2％，5-甲酰-四氫葉酸含量是野生型的114.7％。
　　 2.與野生型相比，基因AtADCL在5個(gè)不同的RNAi轉(zhuǎn)基因株系中的轉(zhuǎn)錄水平均明顯降低，在4個(gè)不同的超表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系中的轉(zhuǎn)錄水平均明顯升高。
　　 3.采用微生物法檢測(cè)了突變體、RN

5、Ai和超表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系的總?cè)~酸含量，我們發(fā)現(xiàn)5個(gè)不同的RNAi轉(zhuǎn)基因株系的總?cè)~酸含量與野生型相比均提高，分別是野生型的146.9％、172.2％、136.0％、126.1％和132.0％。四個(gè)不同的超表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系的總?cè)~酸含量與野生型相比也均提高，分別是野生型的184.3％、173.2％、136.8％和144.7％。
　　 4.將AtADCL的CDS序列構(gòu)建到載體pET30a上，在Rossette(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中通過IPT

6、G誘導(dǎo)進(jìn)行重組蛋白的原核表達(dá)，然后通過SDS-PAGE分析。結(jié)果表明重組蛋白只在沉淀中表達(dá)即以包涵體形式存在。為了檢測(cè)AtADCL在擬南芥中是否具有酶學(xué)活性，就必須得到可溶性的重組蛋白。我們將AtADCL的CDS序列構(gòu)建到融合了一段超酸序列的載體pET-YdRb上，并通過IPTG誘導(dǎo)和SDS-PAGE分析，結(jié)果重組蛋白成功地在上清液中表達(dá)。接下來，我們將收集大量的可溶性重組蛋白，測(cè)定AtADCL在植物體內(nèi)的酶學(xué)活性。
　　 以上

7、結(jié)果說明無論T-DNA插入還是RNA干擾都不能阻斷擬南芥中葉酸的合成途徑，而且令我們驚奇的是，突變體和RNA干擾轉(zhuǎn)基因株系中的總?cè)~酸含量與野生型相比均有提高?？赡艿脑蚴牵?)T-DNA插入和RNA干擾并沒有使基因的功能完全沉默，仍然保留一定的酶學(xué)活性；2)因?yàn)槿~酸對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育起著關(guān)鍵的作用，而pABA又是葉酸合成的一個(gè)前體，所以當(dāng)基因AtADCL(At5G57850)在植物中突變了，一定有其他基因在起作用，從而保證pABA正常合成