克氏原螯蝦兩種模式識別受體基因的克隆、重組表達及功能分析.pdf

1、模式識別受體(Pattern recognition receptor，PRR)是由胚系基因編碼的一類參與病原識別的蛋白質，它們能夠與微生物表面病原相關的分子模式(Pathogen associatedmolecular pattern，PAMP)相互作用而激活宿主的先天性免疫系統(tǒng)。本研究首先在甲殼動物中建立了RNA干擾技術，并利用新建立RNA干擾技術結合基因原核重組、熒光定量PCR等分子生物學技術對克氏原螯蝦(Procambarus

2、clarkii)的兩個模式識別受體基因脂多糖和β-1，3-葡聚糖結合蛋白基因以及C-型凝集素基因進行了研究。 首先，通過體外轉錄合成目標基因的雙鏈RaNA，將雙鏈RNA注射克氏原螯蝦或凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)個體，建立了穩(wěn)定RNA干擾技術，能夠有效沉默目標基因的表達。而且，這種RNA干擾介導的基因沉默效應能夠系統(tǒng)性的發(fā)生，至少持續(xù)96小時，能夠滿足本研究中對模式識別受體基因功能鑒定的要求。

3、 隨后，利用RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)技術從克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)中克隆、鑒定了兩個模式識別受體基因：脂多糖和β-1，3-葡聚糖結合蛋白基因(命名為PcLGBP)和C-型凝集素基因(命名為PcLEC)。 PcLGBP基因cDNA全序列包含一個1107bp的開放閱讀框(Open reading frame，ORF)，編碼369個氨基酸。在N末端有

4、一個17個氨基酸的信號肽，表明PcLGBP是一個分泌的胞外蛋白。PcLGBP蛋白的氨基酸序列中包含一個糖基水解酶結構域和一個β-1，3-糖苷鍵識別序列(Phe235-Asp253)以及兩個細胞粘附位點(RGD106-108，157-159)和一個N糖基化位點(NRSI66-69)。在其類葡聚糖酶結構域還包含決定葡聚糖酶活性的保守氨基酸。同源性分析發(fā)現(xiàn)PcLGBP與甲殼類動物的脂多糖和β-1，3葡聚糖結合蛋白LGBP(Lipopolysa

5、ccharide and pβ-1，3-glucan binding protein，LGBP)或β-1，3葡聚糖結合蛋白(β-1，3-glucan binding protein，BGBP)同源，與一些昆蟲的革蘭氏陰性細菌結合蛋白(Gram-negative bacteria protein，GNBP)及葡聚糖酶的一致性高于40％。為分析PcLGBP基因的功能，通過半定量RT-PCR方法研究了其在組織中的分布，并用熒光定量PCR技術分

6、析了其對細菌刺激的響應，結果表明PcLGBP基因是肝胰腺特異表達的基因，能響應熱致死鰻弧菌刺激而增強表達，說明PcLGBP基因可能參與螯蝦的細菌防御反應。 利用酶聯(lián)免疫法對重組PcLGBP蛋白與細菌和真菌表面多糖的結合活性進行了鑒定，表明重組PcLGBP蛋白能與來源于革蘭氏陰性細菌的脂多糖和來源于真菌的β-1，3-葡聚糖結合，而對來源于革蘭氏陽性細菌的肽聚糖則沒有結合活性。為進一步了解PcLGBP基因在細菌防御中的作用，利用

7、RNA干擾技術沉默PcLGBP基因的表達，并用三種不同的病原菌進行了細菌侵染實驗。PcLGBP基因沉默顯著降低了克氏原螯蝦對革蘭氏陰性細菌的防御能力，而對革蘭氏陽性細菌侵染沒有顯著的影響。 PcLEC基因的cDNA全序列包含一個813bp的ORF，編碼271個氨基酸，在N末端有一個17個氨基酸的信號肽，以及一段富含甘基酸的序列，在C末端有一個糖識別結構域(CarbohLydrate recognition domain，CR

8、D)。另外還有四個半胱氨酸殘基，可能參與形成兩對鏈內二硫鍵。PcLEC同甲殼動物、昆蟲等物種的C型凝集素都有明顯的序列相似性?？臻g結構預測表明，PcLEC與經(jīng)典的半乳糖結合C-型凝集素具有相似的空間結構，有七個β折疊，2個α螺旋共九個二級結構元件，有兩對二硫鍵和一個長環(huán)狀結構，是一個經(jīng)典的短型凝集素。利用實時定量PCR技術對PcLEC基因的組織表達和細菌刺激后的時序表達變化進行了檢測。在肌肉、心、肝胰腺、鰓、性腺和血細胞等六個組織中均檢

9、測到PcLEC基因的表達，其中在血細胞和肝胰腺中的表達量最高，而在肌肉、鰓和性腺中的表達量相對較低。同時，熱致死的細菌注射能顯著增強PcLEC基因的表達。對重組PcLEC蛋白進行凝菌實驗表明重組PcLEC對大腸桿菌、鰻弧菌和藤黃微球菌都表現(xiàn)出依賴Ca2+的凝集效應，這種凝集效應能夠被半乳糖和N-乙酰半乳糖胺抑制。酶聯(lián)免疫實驗進一步證實了PcLEC對半乳糖和N-乙酰半乳糖胺具有較強的結合活性。 本研究的結果表明PcLGBP和Pc

10、LEC分別為革蘭氏陰性細菌結合蛋白和C型凝集素家族的兩個模式識別受體。PcLGBP基因是肝胰腺特異表達的基因，PcLEC基因在肌肉、心、肝胰腺、鰓、性腺和血細胞中均能表達，在血細胞和肝胰腺中表達量最高。二者均能夠被熱致死的鰻弧菌刺激表達上調。PcLGBP蛋白能夠與革蘭氏陰性細菌和真菌的表面多糖脂多糖以及β-1，3-葡聚糖結合，介導克氏原螯蝦革蘭氏陰性細菌侵染的防御。PcLEC蛋白能夠與半乳糖及其衍生物N-乙酰半乳糖胺結合，以鈣離子依賴的