達比加群對凝血酶誘導(dǎo)的人氣道平滑肌細胞外基質(zhì)沉積的影響及機制探討.pdf

1、Huber和Koessler在九十多年前對致死性哮喘的經(jīng)典描述中首次提出了氣道重塑的概念。臨床上，氣道重塑是引起哮喘患者出現(xiàn)不可逆性通氣功能障礙的罪魁禍首。
　　研究表明，增厚的氣道平滑肌(ASM)層是引起哮喘患者產(chǎn)生氣流受限的首要原因。細胞外基質(zhì)(ECM)在正常氣道內(nèi)起物理支撐作用，哮喘中氣道平滑肌細胞(ASMC)異常分泌的ECM不僅會加劇氣道狹窄，還會反向促進ASMC異常增殖及分泌，形成氣道重塑的惡性循環(huán)。因此，ASMC分泌E

2、CM是哮喘氣道重塑防治的重要靶點。
　　肺內(nèi)凝血是近年哮喘防治的研究熱點。凝血系統(tǒng)中的關(guān)鍵蛋白酶凝血酶可以通過與特定的受體結(jié)合，發(fā)揮促炎、促增殖、促遷移等非凝血功能。凝血酶受體（PARs）中PAR-1與PAR-2在肺損傷及炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用，以PAR-1關(guān)系尤為密切。PAR-1在氣道多種結(jié)構(gòu)細胞如肺成纖維細胞、ASMC、上皮細胞的細胞膜上均有表達。目前尚未有報道表明凝血酶-PAR-1對氣道ECM重塑的影響。
　　達比加

3、群酯是一種新型高效的直接凝血酶抑制劑，是最前沿的口服抗凝藥物?；A(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，達比加群對凝血酶-PAR1介導(dǎo)的非凝血功能同樣具有抑制作用。
　　據(jù)此，我們推測凝血酶可能通過與ASMC胞膜上的PAR-1結(jié)合，激活下游ERK1/2信號通路，促進ECM沉積;而達比加群可以抑制這一效應(yīng)。
　　目的:
　　1.分離培養(yǎng)原代人氣道平滑肌細胞并進行鑒定;
　　2.明確凝血酶對ASMC ECM沉積的作用;觀察PAR-1受體抑制劑S

4、CH79797及ERK1/2信號通路抑制劑U0126對這一作用的影響;
　　3.明確凝血酶對ASMC ERK1/2信號通路磷酸化水平的影響;觀察SCH79797及U0126對這一作用的影響;
　　4.明確達比加群干預(yù)凝血酶后，ASMC ECM沉積及ERK1/2信號通路磷酸化水平的變化。
　　方法:
　　1.取南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院胸外科肺葉切除術(shù)患者標本，采用本課題組成熟的組織塊貼壁法分離培養(yǎng)原代人氣道平滑肌細胞。

5、采用特異性免疫熒光染色技術(shù)進行細胞鑒定。
　　2.選擇RT-PCR及Western blot技術(shù)分別檢測不同干預(yù)后ASMC ECM基因及蛋白的表達水平。
　　3.選擇Western blot技術(shù)檢測不同干預(yù)后ASMC ERK1/2的磷酸化水平變化。
　　4.數(shù)據(jù)統(tǒng)計:SPSS20.0軟件統(tǒng)計，采用One-Way ANOVA法進行分析，確定方差齊且組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義后采用LSD法進行多重比較。P＜0.05，差異即有統(tǒng)計

6、學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　(1)原代人氣道平滑肌細胞在光鏡下呈長梭形，生長融合后呈現(xiàn)“峰谷征”;經(jīng)抗α-SMA抗體進行特異性染色后，可見胞質(zhì)內(nèi)均勻分布綠色熒光。
　　(2)①用遞增濃度的凝血酶(0.1-10U/ml)刺激細胞24h，COL-Ⅰα1的表達均顯著增加(P＜0.01)，1.0U/ml達最大效應(yīng);②用1.0U/ml的凝血酶刺激細胞不同時間(12-72h)，COL-Ⅰα1的表達均顯著增加(P＜0.01)，并在48

7、h到達峰值;③用凝血酶(1.0U/ml)刺激細胞12h，COL-Ⅰα1、多功能蛋白聚糖、纖連蛋白mRNA表達均顯著增加(P＜0.01)，而膠原蛋白Ⅲ、層黏連蛋白α1、α2mRNA表達與對照組相比無明顯差異;④SCH79797及U0126均能顯著抑制凝血酶誘導(dǎo)的COL-Ⅰα1(P＜0.01)及ECM基因(P＜0.05)的表達增加。
　　(3)①凝血酶(1.0U/ml)刺激細胞不同時間(5-60min)，ERK1/2磷酸化水平顯著上升

8、(P＜0.05)，呈早期快速磷酸化模式，5min達最大效應(yīng);②SCH79797及U0126均能顯著抑制凝血酶誘導(dǎo)的ERK1/2快速磷酸化(P＜0.01)。
　　(4)達比加群提前干預(yù)細胞30min后，與對照組相比，能顯著抑制凝血酶誘導(dǎo)的COL-Ⅰα1(P＜0.01)、ECM基因(P＜0.05)的表達增加、并能抑制凝血酶誘導(dǎo)的ERK1/2快速磷酸化（P＜0.01）。
　　結(jié)論:
　　1.采用組織塊貼壁法可成功分離培養(yǎng)出原