噬菌體KS461-2部分特性及全基因組分析.pdf

1、2-酮基-D-葡萄糖酸(2-keto-D-gluconic acid，2KGA)是化學(xué)合成食品抗氧化劑D-異抗壞血酸及其鈉赫的前體，在大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)上通常采用細(xì)菌發(fā)酵方法由D-葡萄糖轉(zhuǎn)化而來(lái)。熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)A46是以K1005菌株為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外誘變選育的2KGA高產(chǎn)菌株，其發(fā)酵周期短，轉(zhuǎn)化率高，對(duì)噬菌體KS502、503抗性穩(wěn)定，在國(guó)內(nèi)2KGA工業(yè)生產(chǎn)中得到普遍采用：在近年來(lái)國(guó)內(nèi)2KG

2、A的工業(yè)生產(chǎn)中，該菌株遭受了新的噬菌體侵染，發(fā)酵生產(chǎn)出現(xiàn)異常，給生產(chǎn)企業(yè)帶來(lái)了很大的經(jīng)濟(jì)損失。 噬菌體種類(lèi)繁多，且分布廣泛。因此，在沒(méi)有找到相應(yīng)抗噬菌體菌株的情況下，盡早發(fā)現(xiàn)噬菌體污染并及時(shí)采取補(bǔ)救措施，是減小經(jīng)濟(jì)損失的必要手段。 無(wú)論是研究細(xì)菌與噬菌體間的相互關(guān)系，揭示噬菌體介導(dǎo)的基因水平轉(zhuǎn)移所導(dǎo)致的生物多樣性等相關(guān)問(wèn)題，還是研究噬菌體的工程改造和尋找新的抗噬菌體方法，都需要對(duì)噬菌體及其宿主菌的遺傳背景有清楚的認(rèn)識(shí)。由

3、于噬菌體的基因組可小至數(shù)千、數(shù)萬(wàn)堿基或者堿基對(duì)，因此對(duì)噬菌體基因組的測(cè)序和改造都極具可操作性，對(duì)噬菌體功能基因組學(xué)研究也相對(duì)比較容易，一旦取得成功，其學(xué)術(shù)價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值都不可估量。 本研究以從2KGA產(chǎn)生菌熒光假單胞菌A46異常發(fā)酵液中分離純化得到的噬菌體KS461-2為對(duì)象，初步研究了該噬菌體對(duì)熒光假單胞菌A46的感染及防治策略，并對(duì)已完成全基因組測(cè)序的KS461-2展開(kāi)了基因組學(xué)分析和某些基因功能研究。主要結(jié)果包括以下幾方面

4、： 1.利用透射電鏡觀(guān)察了2-酮基-D-葡萄糖酸產(chǎn)生菌熒光假單胞菌A46感染噬菌體KS461-2后的菌體形態(tài)變化。隨著噬菌體感染時(shí)間的延長(zhǎng)，菌體形態(tài)變化差異顯著。 2.熒光假單胞菌A46耐噬菌體KS461-2的突變頻率在2.5×10-6左右。 3.噬菌體KS461-2在pH7.5-8.0的條件下容易吸附于宿主而增殖。 4.高錳酸鉀、硫酸銅、檸檬酸銨和草酸銨4種常用抗噬菌體藥物中，草酸銨能夠有效抑制該噬菌體

5、的增殖而對(duì)宿主菌的生長(zhǎng)無(wú)明顯影響，最佳添加濃度為0.7％。 5.用DNAStar軟件包中Editseq軟件對(duì)KS461-2基因組的一般特性進(jìn)行分析。KS461-2基因組全長(zhǎng)85229bp，堿基組成：％A=30.51，％G=21.07，％T=29.45，％C=18.97，％稀有堿基=0.00；％A+T=59.96，％C+G=40.04。 6.利用ORF finder軟件進(jìn)行ORFs初步分析，綜合利用針對(duì)一般微生物基因注釋工

6、具glimmer在線(xiàn)分析軟件和softberry網(wǎng)站的Gene Finding in Viral Genomes功能確定出163個(gè)推定基因，對(duì)KS461-2基因組中ORFs進(jìn)行逐個(gè)BLASTx同源檢索分析，得到44個(gè)已知功能的基因。 7.在法國(guó)Pasteur實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)站上對(duì)KS461-2基因組進(jìn)行tRNA分析，預(yù)測(cè)出2個(gè)tRNA，并利用DNA Master模擬出其二級(jí)結(jié)構(gòu)。 8.在EMBL-EBI網(wǎng)站上利用CpG isla

7、nds功能和softberry網(wǎng)站上的CpGFinder功能，分析得到噬菌體基因組上含有7個(gè)大于200bp的GC島。其中，GC含量偏離最大的兩個(gè)基因，即ORF99和ORF100可能是水平轉(zhuǎn)移而來(lái)的外源基因。 9.利用softberry網(wǎng)站opreon and gene finding in bacteria欄中的BPROM(promoterfinding in bacteria)功能，預(yù)測(cè)出噬菌體基因組上101個(gè)可能的啟動(dòng)子。

8、 10.利用法國(guó)巴斯德網(wǎng)站的PALINDROME軟件分析基因組，得到15個(gè)反向重復(fù)序列；EQUICKTANDEM軟件分析未發(fā)現(xiàn)基因組上有串聯(lián)重復(fù)序列。 11.經(jīng)softberry網(wǎng)站上的FindTerm軟件分析，在基因組上共找到了24個(gè)可能的不依賴(lài)ρ-因子的轉(zhuǎn)錄終止子 12.選擇9個(gè)同源蛋白種類(lèi)較多的功能基因，利用DNAStar軟件包中的MegAlign軟件，分別將它們與各自的同源蛋白進(jìn)行了多重對(duì)比，并繪出系統(tǒng)發(fā)生