自噬標志物ATG5與LC3在腎癌組織中的表達及其對腎癌耐藥性的影響研究.pdf

1、目的：
　　腎透明細胞癌約占成人惡性腫瘤的2％～3％，截止2016年的統(tǒng)計學數(shù)據(jù)顯示腎癌仍是我國發(fā)病率約第10位的惡性腫瘤，為成人腎臟惡性腫瘤的主要部分。近些年來其發(fā)病率呈逐年上漲趨向，全球每年約有10萬人死于腎癌，腎癌分布總體上發(fā)病年齡可見于各年齡段，高發(fā)年齡為50～70歲，最近流行病學統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示男性腎癌發(fā)病率略多于女性，地區(qū)差異也比較明顯，城市稍高于農(nóng)村。目前腎癌因缺乏早期特異性的診斷方法導致大部分患者診斷時腫瘤已發(fā)展至中晚

2、期。盡管現(xiàn)在對腎癌的認識有了很大的進步，診療手段也日益增多，但由于腎癌發(fā)生發(fā)展機制仍未明確，故腎癌目前仍以手術治療為主，術后患者生存率仍不太理想。目前，還沒有公認的可用于臨床診斷腎癌的腫瘤標志物。腎癌的術前診斷主要依靠腹部影像學檢查，然而，因影像學診斷的限制，腹部CT一般只能發(fā)現(xiàn)直徑大于5mm以上的腎癌，并且確診還需病理學檢查。因此，探索腎癌可能發(fā)生發(fā)展及耐藥的分子機制對腎癌的診斷、治療及預后評估具有重要意義。
　　目前研究已證明

3、，細胞自噬主要有三種存在形式，包括大自噬(macroautophagy，MA)、分子伴侶自噬(chaperone-mediated autophagy，CMA)和小自噬(microautophagy)。大自噬(macroautophagy，MA)即通常所說的自噬，是使用雙層脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)包裹胞內(nèi)短效周期蛋白形成自噬泡，并且與次級溶酶體（溶酶體）融合后，在溶酶體內(nèi)酸性蛋白降解酶的作用下進行降解再利用。一般在體外細胞培養(yǎng)中，細胞經(jīng)過血清饑餓誘導

4、短期內(nèi)（4-6小時）可以達到高峰。對于小自噬目前研究相對較少，主要是指是通過溶酶體直接與目的蛋白進行融合后降解。
　　近來研宄發(fā)現(xiàn)，自噬可以通過代謝自身蛋白質(zhì)和細胞器來逃避外界應激，以此來維持細胞穩(wěn)態(tài)并促進細胞存活，新近發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞往往通過自噬來增強其對抗癌藥物的耐藥性，以此逃避腫瘤藥物的殺傷作用。自噬相關基因5(ATG5)作為常用自噬檢測關鍵基因之一，其表達水平與自噬明顯相關。微管相干蛋白1輕鏈3(LC3)是目前研究最多的自噬

5、標志性基因之一，其共同參與自噬體的形成，是自噬特異的常用診斷標志物之一。目前，自噬的檢測方法主要包括免疫組織化學中檢測自噬體的形成、western blot檢測LC3。細胞增殖情況常用的檢測技術包括MTT法、流式細胞術等。目前，自噬在腎癌中尤其是其耐藥性的研究尚不深入，本研究采用免疫組織化學染色、慢病毒感染、Western Blot、MTT、流式細胞術等多種實驗方法和技術，從分子和細胞水平，觀察了大自噬在體外腎癌細胞增殖及舒尼替尼耐藥性

6、中的作用及其分子機制。
　　結(jié)果:
　　一、ATG5、LC3在腎透明細胞癌組織中高表達，且與腎透明細胞癌的分級及預后相關
　　1.對99例腎癌組織和17例癌旁組織進行免疫組化染色分析發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，ATG5和LC3在腎透明細胞癌組織中表達量明顯升高。臨床病理資料統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，ATG5和LC3的表達高低與年齡、性別、腫瘤部位無統(tǒng)計學差異，但與腎癌腫瘤惡性程度、TNM分期密切相關;隨著病理學分級和TNM臨床分期的增加

7、，ATG5和LC3的表達依次升高。并且，ATG5高表達患者生存率較低，預后較差。
　　二、大自噬促進A-498腎癌細胞株增殖
　　1.通過慢病毒介導的ATG5shRNA表達載體感染構(gòu)建低表達的A-498腎癌細胞株，并使用Western Blot相關技術進行驗證，成功構(gòu)建了ATG5低表達腎癌細胞株;
　　2.流式細胞術檢測ATG5正常表達與低表達組中A-498細胞增殖的變化;
　　3.7天MTT增殖曲線結(jié)果顯示，敲

8、低A-498腎透明細胞癌株中ATG5表達，能顯著降低腎癌細胞的增殖能力。
　　4.采用H2O2刺激及細胞活力檢測證明，在氧應激情況下，敲低A-498腎癌細胞株中ATG5表達，能顯著降低腎癌細胞的存活率。
　　三、抑制自噬能降低腎癌細胞對舒尼替尼的耐藥性
　　通過MTT實驗發(fā)現(xiàn)，ATG5敲低的A-498腎癌細胞對舒尼替尼藥物的耐藥性增加。
　　結(jié)論:
　　自噬可通過抑制ATG5介導的自噬信號通路來刺激腎癌細胞