玉米和蘆筍中腐馬素的污染分析及擬南芥對FB-,1-的抗性機理研究.pdf

1、腐馬素(fumonisins)是由串珠鐮刀菌和再譽鐮刀菌等鐮刀菌產生的一類真菌毒素。由于其化學結構與動植物中的神經鞘氨醇類物質類似，可以引起動物各種疾病以及植物病害。一方面，腐馬素對某些牲畜有急性毒性及潛在的致癌性，如引起馬腦炎、豬肺水腫或大鼠肝癌，還能引起人類食道癌和神經管缺陷，由于該毒素污染廣泛，在玉米、玉米制品以及蘆筍等農產品中都有報道，嚴重威脅食品安全及人類和動物的健康；另一方面，腐馬素可以誘導植物的細胞程序化死亡以及過敏性反應

2、，在模式植物擬南芥中腐馬素誘導細胞程序化死亡是研究植物對化學脅迫的抗性、植物免疫機理以及神經鞘脂功能的良好體系。本研究中，建立了用于玉米等食品中腐馬素檢測的HPLC-ELSD方法，分析了我國不同地區(qū)，特別是食管癌高發(fā)區(qū)玉米和玉米制品上腐馬素污染狀況；結合LC-MS分析了浙江省蘆筍中腐馬素污染情況；并利用PCR檢測和產毒培養(yǎng)等方法，研究了玉米及蘆筍中產生腐馬素的原因。此外，以擬南芥為材料，篩選并初步分析了兩個抗FB1的突變體，同時研究了芥

3、子油苷在擬南芥對FB1抗性中的作用。主要研究結果如下： 利用腐馬素標準品和野生型串珠鐮刀菌A0149產毒培養(yǎng)玉米為材料，結合常規(guī)的HPLC-OPA衍生法建立了不需要衍生的快速可靠的HPLC-ELSD方法，腐馬素B1(FB1)在3-24μg之間其物質的量與峰面積分別取自然對數后有良好的線性關系，最低檢出限約為60ng，可以同時檢測B系列四種腐馬素。利用該方法分析了我國東北地區(qū)、中東部地區(qū)和東南部地區(qū)玉米中腐馬素的污染水平，結果表明

4、，腐馬素的整體污染水平較低，只檢出了FB1，中東地區(qū)玉米陽性樣品中腐馬素范圍在0.25-1.8μg/g(平均，0.74μg/g)，檢出率為66.7％(15/24)，東北地區(qū)玉米陽性樣品中腐馬素范圍在0.21-0.29μg/g(平均，0.24μg/g)，檢出率為28.6％(6/21)，東南部地區(qū)玉米陽性樣品中腐馬素范圍在0.30-3.13μg/g(平均，0.47μg/g)，檢出率為30.0％(6/20)。 我國的河南林縣被認為是世

5、界上食道癌發(fā)生與玉米中腐馬素污染密切相關的地區(qū)之一。我們利用建立的HPLC-ELSD方法，研究了該地區(qū)不同來源和不同表觀特征的玉米，以及不同玉米制品中腐馬素的污染狀況。結果表明，來自農戶、糧倉，中心市場，商店以及超市的共140份玉米樣品中FB1檢出率分別為61.5％(16/26)，50％(12/24)，33.3％(12/36)，17％(2/12)，0％(0/6)。來自糧庫的玉米樣品中腐馬素污染水平最高(0.25-1.80μg/g；平均，

6、0.73μg/g)，其次是來自農戶(0,25-1.80μg/g；平均，0.73μg/g)，而來自中心市場(0.25-1.10μg/g；平均，0.51μg/g)和商店較輕(0.22-0.34μg/g；平均，0.28μg/g)。對80個來自當地農戶玉米樣品分析后發(fā)現，24個霉變玉米樣品中18個檢出了較高水平的腐馬素B1(0.28-3.30μ/g；平均，1.58μg/g)，而56份外觀健康的玉米中有20份也檢出了腐馬素B1(0.21-0.82

7、μg/g；平均，0.46μg/g)。來自中心市場的115份玉米食品和飼料樣品中，飼料中腐馬素的含量最高(0.30-3.13μg/g；平均，1.50μg/g)，其次是非加工食品(0.31-0.63μg/g，平均，0.47μg/g)，加工食品中污染最輕(0.21-0.28μg/g，平均，0.25μg/g)，其檢出率分別為53.6％，33.3％和17.9％。總之，來自林縣地區(qū)的玉米食品和玉米飼料中腐馬素污染水平較低(<2μg/g)，但是對糧倉

8、和農戶貯藏玉米的腐馬素污染還需要采取措施加以控制。 為了研究玉米中腐馬素污染的原因，我們采用形態(tài)學鑒定和分子檢測相結合的辦法，研究了收集玉米中鐮刀菌的污染狀況，并通過產毒培養(yǎng)方法分析了分離菌株的產毒能力?？傮w看來，玉米樣品中真菌，鐮刀菌和腐馬素產毒菌的污染率分別為42.18％，35.94％和29.69％，其中鐮刀菌和產毒菌分別占總污染菌的74.19％(23/31)和61.29％(19/31)。PCR檢測和產毒培養(yǎng)結果表明，共有三

9、種鐮刀菌在玉米培養(yǎng)基上產生了腐馬素，分別為串珠鐮刀菌、再譽鐮刀菌和膠孢鐮刀菌。產毒能力分析表明，不同菌種之間以及相同菌種的不同菌株之間產毒能力差異顯著，產毒菌株的產毒能力從186μg/g到16784μg/g，平均為4637μg/g，其中FB1占主要部分為87.1％(75.8-94.6％，平均產量4041μg/g)；第二類主要毒素為FB2，平均產量為642μg/g，范圍為46-2308μg/g，而且所有的串珠鐮刀菌和再譽鐮刀菌也都產生FB

10、3，平均產量為189μg/g，范圍為42-711μg/g。不同地區(qū)腐馬素產毒菌株污染狀況不同，其中以中東部地區(qū)污染最重，共從24份樣品中分離到14個污染菌，其中9個為產毒菌，而且污染的鐮刀菌種類也最多，除了串珠鐮刀菌外，還有再譽鐮刀菌、禾谷鐮刀菌和木賊鐮刀菌；東南部地區(qū)則最輕，從19份樣品中分離到5個菌株，而且只有一株產毒菌株；東北地區(qū)21份玉米中共分離到12個菌株，所有的9個鐮刀菌均為產毒菌株，包括兩個產毒的膠孢鐮刀菌。我們的研究表明

11、，這些外觀潔凈的食用玉米中仍然存在腐馬素及產毒菌的污染，這可能是采前受到產毒病原菌侵染，但采后過程中可能不適合產毒造成的，由于這些產毒菌的產毒能力較強，如果條件適宜，仍然存在大量毒素污染的可能性。 HPLC-ELSD和LC-MS分析都表明浙江省地區(qū)食用蘆筍樣品中沒有腐馬素污染。從22份蘆筍樣品中共分離到9株再譽鐮刀菌，5株尖孢鐮刀菌，1株木賊鐮刀菌和1株銳頂鐮刀菌，復合PCR分析表明，所有的再譽鐮刀菌均擴增出了腐馬素生物合成基因

12、FUM1和FUM8片段，而且其產毒能力較強，在玉米培養(yǎng)基中總腐馬素的平均產量為1603.5μg/g，范圍27.8-4204.0μg/g，產生FB1為148.2-3850.2μg/g(平均，1355.9μg/g)，產生FB2為21.4-543.0μg/g(平均，153.1μg/g)，產生FB3為0-434.2μg/g(平均，106.4μg/g)，其中5株屬于高產毒菌(＞500μg/g)，3株屬于中產毒菌(50-500μg/g)。而其他菌株

13、則只檢測到鐮刀菌特異的ITS片段，產毒培養(yǎng)和液相分析證實了存在產毒爭議的尖孢鐮刀菌確實不能產生FBs。我們的結果表明，浙江省食用蘆筍中沒有腐馬素的污染，但能夠產生真菌毒素的鐮刀菌污染較重，這些菌株不僅可以引起蘆筍的病害而且可以產生對人體有害的真菌毒素，應引起重視并加以控制。 本研究還建立了一種擬南芥抗腐馬素突變體的篩選方法，利用1μM的FB1培養(yǎng)基從EMS誘變的哥倫比亞生態(tài)型Col-0突變體庫中篩選得到兩株抗FB1的突變體fbr

14、41和fbr42。在正常條件下，兩個突變體表現出植株矮化，葉片邊緣鋸齒，以及側根相對發(fā)達等異常表型；在1μMFB1培養(yǎng)基上，根毛發(fā)達，葉片變硬，只在根等部位產生少量活性氧，其抗性遠強于激素突變體jar1，ein3-1，npr1和轉基因NahG，最大FB1抗性濃度在2μM左右；遺傳學分析表明，fbr41為隱性單基因突變。 10μMFB1外源處理野生型擬南芥Col-0后，HPLC分析表明，短鏈脂肪類芥子油苷含量下降，而長鏈脂肪類芥子

15、油苷含量略有升高；吲哚基-3-甲基芥子油苷(Indol-3-ylmethylGS，IM)的含量明顯下降，和而4-甲氧吲哚基-3-甲基芥子油苷(4-methoxyindol-3-ylmethylGS，41M)和1-甲氧吲哚基-3-甲基芥子油苷(1-methoxyindol-3-ylmethylGS，1IM)則明顯升高；而長鏈脂肪類芥子油苷缺失但吲哚類含量高的突變體gsm1-3和所有芥子油苷組分都低的突變體gcc8同樣在FB1處理后被極大地

16、誘導了41M和1IM，而且gsm1-3表現出稍好的抗性，這預示不是長鏈脂肪類芥子油苷而可能是4IM和1IM參與了對FB1的抗性作用。對芥子油苷生物合成途徑相關基因分析表明，與抗病相關的camalexin和IAA生物合成基因(PAD3和NIT2)的表達在處理與對照之間沒有明顯差異，而參與吲哚類芥子油苷生物合成的CYP8381卻極大的上調；此外，我們對篩選的兩個擬南芥抗FB1突變體的芥子油苷及其生物合成相關基因也進行了分析，結果表明，兩個突