p38-NFκB-IL-6在運(yùn)動(dòng)介導(dǎo)大鼠骨骼肌生物發(fā)生的作用.pdf

1、肌肉發(fā)生是肌肉可塑性和肌肉發(fā)育的重要的生物學(xué)基礎(chǔ)。狹義的肌肉發(fā)生最初是指在胚胎發(fā)育過程中,體節(jié)細(xì)胞經(jīng)過一些列增殖、遷移、分化,最終形成肌肉組織的過程,廣義的肌肉發(fā)生還包括了成體肌纖維的發(fā)生的內(nèi)容,包括了成體干細(xì)胞(主要指衛(wèi)星細(xì)胞)成長為成熟肌細(xì)胞、肌纖維核上調(diào)某些肌肉特異性結(jié)構(gòu)、功能蛋白表達(dá)等過程。醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)、體育學(xué)的多方面研究都涉及到肌肉發(fā)生,如肌肉創(chuàng)傷、老年退行性少肌癥和肌營養(yǎng)不良癥的治療、畜禽養(yǎng)殖、運(yùn)動(dòng)介導(dǎo)的肌肉適應(yīng)性變化等。肌肉

2、發(fā)生涉及了一系列復(fù)雜的分子事件,對細(xì)胞外信號(hào)系統(tǒng)如GH/IGF-1通路等已經(jīng)有深入的研究,但是細(xì)胞內(nèi)分子事件迄今為止我們?nèi)詫Υ酥跎佟38/NF-KB/IL-6是近年來發(fā)現(xiàn)的肌肉發(fā)生的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路,自此發(fā)現(xiàn)以來就受到廣泛的關(guān)注。運(yùn)動(dòng)條件下該通路的研究國內(nèi)外未見報(bào)道,且肌肉發(fā)生也是體育研究中最重要的領(lǐng)域,因此本研究以此通路為主干進(jìn)行研究,對其在運(yùn)動(dòng)中的動(dòng)力學(xué)特征進(jìn)行檢測,并對其作用進(jìn)行分析。 具體來說,本研究的目的為：

3、 1、探索急性大、中強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后,肌肉發(fā)生通路因子p38、NF k B、IL-6和肌肉發(fā)生因子及輔助因子MRFs、MEF2c的相位變化,肌肉發(fā)生組織學(xué)微觀指標(biāo)衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)的變化及肌肉損傷組織學(xué)標(biāo)志肌絲和Z線排列的變化。探討上述運(yùn)動(dòng)方案中,p38、NF k B、IL-6在生物發(fā)生的作用、三者之間的信號(hào)聯(lián)系、不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度肌肉發(fā)生效果和機(jī)制的差異。 2、p38/NF k B/IL-6進(jìn)行逐級阻斷,檢測急性大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后的NF k

4、B蛋白總量、磷酸化水平、IL-6 mRNA及肌肉發(fā)指標(biāo)-MRFs和MEF2c mRNA、衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)、損傷的組織學(xué)微觀結(jié)構(gòu)肌絲和Z線排列的變化。對p38/NF kB/IL-6的通路存在及各因子作用進(jìn)一步確認(rèn)。 3、檢測2周大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后,p38蛋白水平、磷酸化水平、NF k B蛋白水平、磷酸化水平、IL-6 mRNA及肌肉發(fā)生生化指標(biāo)-MRFs和MEF2c mRNA、肌肉發(fā)生的組織學(xué)微觀結(jié)構(gòu)指標(biāo)-衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)、肌肉發(fā)生

5、宏觀指標(biāo)-腓腸肌和體重、損傷的組織學(xué)微觀結(jié)構(gòu)肌絲和Z線排列的變化,探討長期運(yùn)動(dòng)后p38、NF k B、IL-6在肌肉生物發(fā)生的作用、三者之間的信號(hào)聯(lián)系、比較與急性運(yùn)動(dòng)的異同。 本研究分為三部分,研究方法與結(jié)論如下。 一、急性大、中強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對大鼠骨骼肌生物發(fā)生的影響方法：1、選用雄性SD大鼠66只,按體重分層后,每組6只,分為11組(盡量減小組間的體重的差異)：對照組(C1組)、急性大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)即刻組(H-Oh組)、急性運(yùn)動(dòng)

6、后1h組(H-1h組)、急性運(yùn)動(dòng)后6h組(H-6h組)、急性大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后16h組(H-16h組)、急性大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后24h組(11-24組)、急性中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)即刻組(M-Oh組)、急性中等運(yùn)動(dòng)后1h組(M-1h組)、急性中等運(yùn)動(dòng)后6h組(M-6h組)、急性中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后16h組(M-16h組)、急性中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后24h組(M-24組)。所有運(yùn)動(dòng)組適應(yīng)性訓(xùn)練后,休息兩天,開始一次1h的大強(qiáng)度或中等強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)。運(yùn)動(dòng)后取腓腸肌肌肉,檢測p38蛋

7、白總量、磷酸化水平(方法:WESTERN BLOTTING)、NF k B蛋白總量、磷酸化水平(ELISA)、IL-6 mRNA及肌肉發(fā)生生化指標(biāo)--MREs和MEF2c mRNA(方法:RT-PCR)、肌肉發(fā)生的組織學(xué)微觀結(jié)構(gòu)指標(biāo)--衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)、損傷的組織學(xué)微觀結(jié)構(gòu)肌絲和Z線排列的變化(方法：透射電鏡)。結(jié)果和結(jié)論：急性運(yùn)動(dòng)后,大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后,p38活性、NF-K B活性、IL-6 mRNA上調(diào)時(shí)段(0-6h)-致,但是逐點(diǎn)檢測

8、變化趨勢發(fā)現(xiàn)有不同不之處。MRFs mRNA在1-16h時(shí)段上調(diào)、MEF2c在1-6h上調(diào)。中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后,p38活性在0-6h、NF-K B活性在0-1h、IL-6mRNA在0-1h上調(diào),MRFs 6h才開始上調(diào),并且只有MyoD上調(diào),MEF2c在0-1h上調(diào)。大、中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)度運(yùn)動(dòng)后,Myf-5均不變。在相同相位點(diǎn),大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)造成因子變化更劇烈。兩種強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后衛(wèi)星細(xì)胞形態(tài)沒有顯著變化。各因子上調(diào)時(shí)段的重疊情況及變化幅度、上調(diào)次序提示

9、,p38/NF-K B/IL-6/MyoD、MyoG、MRF4、MEF2c可能是急性大而非中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)介導(dǎo)肌肉發(fā)生重要通路,大強(qiáng)度對因子刺激更強(qiáng)烈,對于肌肉發(fā)生效果更明顯。衛(wèi)星細(xì)胞形態(tài)無顯著變化提示,非損傷性的運(yùn)動(dòng),衛(wèi)星細(xì)胞激活較晚。損傷可能是運(yùn)動(dòng)激活衛(wèi)星細(xì)胞重要因素而非必要前提,也可能說明,是肌纖維而不是衛(wèi)星細(xì)胞是急性運(yùn)動(dòng)介導(dǎo)下p38/NF-K B/IL-6/MyoD、MyoG、MRF4、MEF2c信號(hào)通路活動(dòng)的主要場所。 二

10、、p38/NF-K B/IL-6阻斷對急性大強(qiáng)運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)肌肉發(fā)生的影響方法：選用雄性SD大鼠66只,按體重分層后,每組6只,分為11組(盡量減小組間的體重的差異)：急性運(yùn)動(dòng)即刻組(Oh組)、急性運(yùn)動(dòng)即刻組+NF-k B阻斷(Oh/NF-k B組)、急性運(yùn)動(dòng)后1h組(1h組)、急性運(yùn)動(dòng)后1h組+NF-k B阻斷(1h/NF-k B組)、急性運(yùn)動(dòng)后6h組(6h組)、急性運(yùn)動(dòng)后6h組+-NF-k B阻斷(6h/NF-k B組)、急性運(yùn)動(dòng)后6h組

11、+p38阻斷(6h/p38組)、急性運(yùn)動(dòng)后16h組(16h組)、急性運(yùn)動(dòng)后16h組+NF-k B阻斷(16h/NF-k B組)、急性運(yùn)動(dòng)后24h組(24h組)、急性運(yùn)動(dòng)后24h組+NF-k B阻斷(24h/NF-k B組)。檢測NF k B蛋白總量、磷酸化水平、IL-6 mRNA及肌肉發(fā)生生化指標(biāo)--MRFs和MEF2c mRNA、肌肉發(fā)生的組織學(xué)微觀結(jié)構(gòu)指標(biāo)--衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)、損傷的組織學(xué)微觀結(jié)構(gòu)肌絲和Z線排列的變化,方法同上。

12、 結(jié)果和結(jié)論：本研究通過阻斷技術(shù)進(jìn)一步研究了p38/NF-KB/IL-6 在急性運(yùn)動(dòng)介導(dǎo)下對肌肉發(fā)生發(fā)揮作用,得到肯定的結(jié)果。具體發(fā)現(xiàn),p38阻斷預(yù)處理能夠降低運(yùn)動(dòng)后6h時(shí)刻N(yùn)F-KB、IL-6、MRFs(Myf-5外)、MEF2c的mRNA水平；NF-КB阻斷預(yù)處理能夠降低運(yùn)動(dòng)后6h IL-6、MRFs(Myf-5外)、MEF2 mRNA水平,降低16h MyoG mRNA水平,上述均為大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后各基因上調(diào)時(shí)段。這表明p38/

13、NF-КB/IL-6在急性大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后早期階段確實(shí)可能發(fā)揮對MRFs和MEF2c的調(diào)節(jié)。但本研究采用阻斷劑的結(jié)果應(yīng)該被謹(jǐn)慎的看待；因?yàn)镻DTC有抗氧化作用、p38對MRFs和MEF2有直接的調(diào)控作用、NF-KB/INOS/NO作用可能加速M(fèi)yoD mRNA的分解,這些可能對p38/NF-КB/IL-6/MRFs、MEF2c通路判斷有干擾。SB203580只能阻斷p38 α、β,骨骼肌同樣高表達(dá)并在運(yùn)動(dòng)中會(huì)被激活的p38 γ的作用無法體現(xiàn)

14、,值得進(jìn)一步研究。此外,活體信號(hào)通路阻斷與細(xì)胞培養(yǎng)不同,實(shí)際即使是局部肌肉注射也無法保證阻斷劑的作用局限于局部,是否是阻斷劑對其他組織(如神經(jīng)系統(tǒng))的影響繼而影響了肌肉指標(biāo)的變化也需要考慮,阻斷劑有多少能夠作用與局部也是個(gè)問題。三、2周大強(qiáng)度對大鼠骨骼肌生物發(fā)生的影響方法：選用雄性SD大鼠18只,按體重分層后,每組6只,分為3組(盡量減小組間的體重的差異)：對照組(C2組)、2周大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后48h組(48h組)、2周大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)48h組+

15、NF-кB阻斷(48h/NF-кB組)。檢測p38蛋白總量、磷酸化水平、NFкB蛋白總量、磷酸化水平、IL-6 mRNA及肌肉發(fā)生生化指標(biāo)-MRFs和MEF2c mRNA、肌肉發(fā)生的組織學(xué)微觀結(jié)構(gòu)指標(biāo)--衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)、損傷的組織學(xué)微觀結(jié)構(gòu)肌絲和Z線排列的變化。檢測手段同上。 結(jié)果與結(jié)論：2周大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)能夠使腓腸肌/體重質(zhì)量增長、衛(wèi)星細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化,上調(diào)p38、NF-КB活性、上調(diào)MyoD、Myf-5、MyoG、MEF2c

16、 mRNA水平,但不影響IL-6 mRNA水平。NF-КB阻礙了腓腸肌的增長幅度、上述運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)活性或基因表達(dá)量上升及衛(wèi)星細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化的幅度。這可能表明,長期規(guī)律性的大強(qiáng)度訓(xùn)練能夠通過p38/NF-КB/?/MyoD、Myf-5、MyoG、MEF2c mRNA通路促進(jìn)肌肉發(fā)生。本研究不支持IL-6參與了長期運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)肌肉發(fā)生能力改善的過程,但是這個(gè)結(jié)論需要謹(jǐn)慎看待。 全文總結(jié)： 1、急性大、中強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)均可引起p38、N

17、F-КB的磷酸化水平、IL-6、MRFs和MEF2c的mRNA水平-過性上升,但組織學(xué)上,衛(wèi)星細(xì)胞和肌絲排列、Z線排列沒有明顯變化。與中等強(qiáng)度相比,大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后24h內(nèi),p38、NF-КB活性、IL-6 mRNA變化較為同步,呈現(xiàn)更明顯的信號(hào)通路特征。大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后上述因子變化幅度更大。 2、p38和NF-КB的阻斷引起相關(guān)指標(biāo)的改變,確認(rèn)急性大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)中,p38/NF-KB/IL-6/MEF2c和MRFs存在信號(hào)通路。 3、長時(shí)