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文檔簡介
1、植物受到干旱、低溫和鹽等逆境境脅迫時,植物內(nèi)源 ABA濃度升高,環(huán)境信號通過一系列信使傳遞,并誘導(dǎo)多種基因轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平的改變,而 ABA信號傳導(dǎo)通路是一條重要的與脅迫應(yīng)答相關(guān)的信號傳導(dǎo)途徑,且植物激素 ABA在種子成熟萌發(fā)、植株生長發(fā)育和對逆境脅迫應(yīng)答中也有關(guān)鍵調(diào)控作用。
ABA信號通路作為一個復(fù)雜的磷酸化級聯(lián)反應(yīng),涉及多種正、負(fù)調(diào)控因子。通過對擬南芥的分子遺傳學(xué)研究,已鑒定出多種 ABA信號傳導(dǎo)途徑的組分,包括蛋白激酶、
2、蛋白磷酸酶和多種轉(zhuǎn)錄因子等,其中Ser/Thr蛋白磷酸酶 PP2C家族成員在ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中作為負(fù)調(diào)控因子起重要作用。目前,植物中發(fā)現(xiàn)的多種 PP2C類磷酸酶均參與 ABA的信號傳導(dǎo)。
迄今為止,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)擬南芥 PP2C家族的成員如 ABI1、ABI2、HAB1、HAG3和PP2CA等,它們均為ABA信號途徑負(fù)調(diào)控因子,其中ABI1是ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的核心組分。它們通過改變 ABA信號的強(qiáng)弱調(diào)控植物的脅迫應(yīng)答,從而影響與
3、ABA信號傳導(dǎo)相關(guān)的植物表型和生理性狀,且認(rèn)為ABI1基因的表達(dá)水平可影響植物的生長發(fā)育和抗逆性。
鹽芥是與擬南芥近緣的植物耐逆分子遺傳學(xué)研究模式系統(tǒng)。因此對鹽芥 ThABI1基因的克隆以及對其功能、機(jī)理等方面的研究有助于進(jìn)一步深化對植物ABA信號途徑的認(rèn)識,從而更好地理解鹽芥耐脅迫機(jī)理,為植物的耐逆性改良奠定基礎(chǔ)。
本研究主要包括以下幾方面內(nèi)容:
1.鹽芥 ThABI1基因 cDNA全長的克隆及序列分析。
4、
2.野生型鹽芥 ThABI1基因的耐逆研究:
干旱、鹽、冷和ABA處理野生型鹽芥后,實時定量 PCR檢測 ThABI1基因的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)以上脅迫條件下 ThABI1基因的表達(dá)水平均有不同程度的上調(diào)。
3.過量表達(dá)鹽芥 ThABI1研究其功能:
ThABI1全長基因與帶有Basta篩選標(biāo)記的植物表達(dá)載體 pCAMBIA3301連接,構(gòu)建35S∷ThABI1過量表達(dá)載體,并導(dǎo)入農(nóng)桿菌后進(jìn)行鹽芥花序
5、侵染;0.2%Basta除草劑篩選鹽芥轉(zhuǎn)化子;對初篩的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行分子鑒定:PCR擴(kuò)增其 Bar基因(500bp),其中7株獲得 PCR陽性結(jié)果,說明35S∷ThABI1的pCAMBIA3301H過量表達(dá)載體已整合到野生型鹽芥的基因組。
4.鹽芥 ThABI1的基因沉默研究其功能:
將 ThABI1基因的部分序列(218bp)構(gòu)建 ThABI1∷pCAMBIA3301基因沉默表達(dá)載體;并導(dǎo)入農(nóng)桿菌后進(jìn)行鹽芥花序侵染
6、;0.2%Basta除草劑篩選鹽芥轉(zhuǎn)化子。
對初篩的鹽芥轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行分子鑒定:(1)PCR擴(kuò)增其 Bar基因(500bp),其中6株獲得 PCR陽性結(jié)果,說明 ThABI1∷pCAMBIA3301沉默載體已整合到鹽芥野生型的基因組;(2)鹽芥轉(zhuǎn)基因株系的實時定量 PCR分析發(fā)現(xiàn),部分轉(zhuǎn)基因株系 ThABI1基因表達(dá)水平與野生型相比有不同程度的降低;(3)60μmol/LABA分別處理轉(zhuǎn)基因植株0、3和6小時后,實時定量 PC
7、R檢測 ThABI1基因的表達(dá)水平,結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株中ABI1基因的表達(dá)水平受 ABA誘導(dǎo)上調(diào)。說明 ThABI1參與了植株對環(huán)境脅迫的響應(yīng),且對干旱和外源 ABA誘導(dǎo)較敏感;ThABI1的進(jìn)一步分子鑒定和功能研究仍在進(jìn)行中。
5.擬南芥 AtHKT1啟動子∷ThHKT1轉(zhuǎn)基因植株的耐逆研究:
對擬南芥 AtHKT1啟動子∷ThHKT1轉(zhuǎn)基因純合子植株(宋開俠師姐獲得)進(jìn)行以下分析:(1)0、75、125 mmol
8、/L不同濃度 NaCl分別處理擬南芥 HKT1突變體(sas2-1)、野生型和擬南芥轉(zhuǎn)基因植株,分別測定其植株的Na+、K+含量,結(jié)果表明較之于野生型,轉(zhuǎn)基因植株和sas2-1地上部分均積累更多 Na+,但 sas2-1表現(xiàn)更加明顯,說明鹽脅迫條件下AtHKT1啟動子∷ThHKT1的轉(zhuǎn)基因植株可減少 Na+轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入擬南芥 sas2-1地上部分;(2)0、50、100 mmol/L不同濃度 KCl分別處理擬南芥轉(zhuǎn)基因植株、野生型及sas2
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