魚腥藻FACHB709堿性磷酸酶基因無機磷饑餓應(yīng)答調(diào)控反應(yīng).pdf

1、藍藻(藍細菌)是一類古老的具有放氧光合作用的革蘭氏陰性細菌，在漫長的自然選擇過程中進化出獨特的環(huán)境適應(yīng)能力，廣泛分布于不同的生境中。由于水體的富營養(yǎng)化，藍藻常常爆發(fā)形成水華，甚至釋放毒素，成為世界性的環(huán)境問題，引起公眾的關(guān)注。對磷極高的生物利用率是藍藻獲得生態(tài)競爭優(yōu)勢、導(dǎo)致藍藻水華發(fā)生的關(guān)鍵因素。雖然富營養(yǎng)化水體中磷源非常豐富，但藍藻等微生物能直接利用的無機磷卻很缺乏。因此，闡明藍藻細胞利用不同形式磷源的代謝調(diào)控，對揭示藍藻水華發(fā)生的分

2、子機制、監(jiān)測藍藻水華發(fā)生具有重要的意義。
　　 魚腥藻(Anabaena sp.)FACHB709是來源于淡水湖泊(中國，武漢東湖)的一種絲狀固氮藍藻。該藻與模式生物魚腥藻(Anabaena sp.)PCC7120高度同源，具有遺傳操作系統(tǒng)，可通過接合轉(zhuǎn)移將重組基因?qū)爰毎?。本論文利用微生物學(xué)、生物信息學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，研究了不同磷源對魚腥藻FACHB709生長的影響、發(fā)現(xiàn)并鑒定了在藻細胞的磷代謝調(diào)控過程中具有關(guān)鍵作

3、用的堿性磷酸酶基因，并通過分析多個堿性磷酸酶基因?qū)Σ煌自吹谋磉_調(diào)控及其生理功能，以期揭示魚腥藻FACHB709堿性磷酸酶基因在磷代謝調(diào)控中的作用機制。
　　 本論文包括以下主要研究內(nèi)容和結(jié)果：
　　 (1)研究了不同種類、不同濃度磷源對魚腥藻FACHB709生長和堿性磷酸酶活性的影響，結(jié)果表明磷缺乏誘導(dǎo)藻細胞生長抑制而不是死亡；魚腥藻細胞通過上調(diào)堿性磷酸酶活性應(yīng)對磷饑餓。磷饑餓細胞在無機磷不存在的條件下，能利用有機磷G

4、-6-P和pNPP獲得部分生長。同時，有機磷的利用可在一定程度上導(dǎo)致細胞總堿性磷酸酶活性下降。
　　 (2)分析魚腥藻FACHB709和其它幾種藍藻的親緣關(guān)系，發(fā)現(xiàn)魚腥藻FACHB709是魚腥藻PCC7120和產(chǎn)水華藍藻-多變魚腥藻(Anabaena variabilis)ATCC29413的近源種。利用近緣種中公認的堿性磷酸酶基因序列，擴增并克隆了魚腥藻FACHB709中可能的堿性磷酸酶基因，對克隆的全基因DNA片段測序和分析

5、，發(fā)現(xiàn)魚腥藻FACHB709中存在四個堿性磷酸酶基因，分別為phoA-709、phoD1-709、phoD2-709和phoS-709。
　　 (3)構(gòu)建了魚腥藻FACHB709堿性磷酸酶基因啟動子和β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的轉(zhuǎn)錄融合重組質(zhì)粒，并將重組質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移到魚腥藻FACHB709，通過測定所得魚腥藻調(diào)控報告菌株的β-半乳糖苷酶活性，分析四個堿性磷酸酶基因在不同濃度無機磷存在條件下的表達調(diào)控。結(jié)果表明，無機磷充足條件

6、下，除了phoD2-709沒有轉(zhuǎn)錄活性外，其余三個堿性磷酸酶編碼基因phoA-709、phoD1-709和phoS-709都有轉(zhuǎn)錄活性；無機磷缺乏條件下，四個堿性磷酸酶基因通過上調(diào)轉(zhuǎn)錄水平，參與魚腥藻FACHB709的磷代謝調(diào)控反應(yīng)，其中以phoA-709的作用最為顯著。
　　 (4)利用免疫學(xué)方法，研究了魚腥藻FACHB709中四個堿性磷酸酶基因在蛋白水平的表達和分布。結(jié)果顯示無機磷缺乏條件下，四個堿性磷酸酶基因的表達水平全部

7、升高，且它們的表達產(chǎn)物分泌到了細胞外培養(yǎng)基中。
　　 (5)構(gòu)建堿性磷酸酶基因缺失突變株DRTH65(敲除phoA-709)和DRTH61(敲除phoS-709)，檢查突變株的生長和生理表型，結(jié)果表明在實驗條件下，突變株DRTH65和DRTH61的生長和堿性磷酸酶活性與野生型魚腥藻的沒有差異。通過分析單個堿性磷酸酶基因缺失后，其余APase基因的表達調(diào)控，發(fā)現(xiàn)在含磷和缺磷條件下，phoD1-709和phoS-709轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)

8、一定程度上可彌補phoA-709的失活；而phoD1-709和phoA-709轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)則一定程度上彌補了phoS-709的失活。
　　 本論文得到以下主要結(jié)論：
　　 (1)無機磷是魚腥藻FACHB709細胞吸收和利用的主要磷源形式和關(guān)鍵生長因子；藻細胞通過調(diào)控堿性磷酸酶活性應(yīng)對無機磷饑餓誘導(dǎo)的細胞生長抑制。
　　 (2)魚腥藻FACHB709是魚腥藻PCC7120的近緣種，并且具有與之相同的堿性磷酸酶基因

9、組成和序列高度同源的堿性磷酸酶PhoA-709、PhoD1-709、PhoD2-709和PhoS-709。
　　 (3)磷饑餓誘導(dǎo)魚腥藻FACHB709中四個堿性磷酸酶基因phoA-709、phoD1-709、phoD2-709和phoS-709轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的上調(diào)，但轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)的程度存在差異。其中，phoA-709在藻細胞磷源代謝調(diào)控中具有關(guān)鍵作用。
　　 (4)魚腥藻FACHB709中四個堿性磷酸酶PhoA-7