鈍頂螺旋藻(Spirulina platensis)反義pepc載體的構(gòu)建、表達(dá)及轉(zhuǎn)化藻的篩選.pdf

1、生物柴油作為化石能源的替代燃料已在國(guó)際上得到廣泛應(yīng)用。至今生物柴油原料主要來自油料植物，但較高的原料成本限制了生物柴油的進(jìn)一步推廣。微藻作為高效光合生物有其特殊的原料成本優(yōu)勢(shì)。微藻生物柴油開發(fā)的關(guān)鍵是篩選到合適的高油微藻。大量研究表明，適合產(chǎn)業(yè)化的高油微藻必須具有以下特征：生長(zhǎng)快、含油量高、適應(yīng)能力強(qiáng)、易于采收、易于建立低成本的開放式培養(yǎng)。在眾多微藻中，螺旋藻產(chǎn)業(yè)化最為成熟，生產(chǎn)快，培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，因此可以作為生物柴油原料的備選藻種。但是

2、其蛋白含量高達(dá)60％以上，而脂類含量?jī)H占細(xì)胞干重的3％左右。為了提高其脂類含量，我們?cè)噲D通過基因工程手段對(duì)其代謝途徑進(jìn)行改造。
　　 研究表明，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)與植物含油量有著密切的關(guān)系。其間接控制了油脂、蛋白質(zhì)生物合成的共同底物磷酸烯醇式丙酮酸的流向，從而決定植物種子蛋白質(zhì)/油脂含量比例。因此利用反義RNA技術(shù)抑制PEPC活性，有可能使代謝流更加充分地轉(zhuǎn)向螺旋藻的脂肪代謝途徑，從而獲得高含油量的轉(zhuǎn)基因螺旋藻。

3、
　　 本研究主要研究結(jié)果如下：
　　 (1)克隆了鈍頂螺旋藻869Spepc基因全長(zhǎng)，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，鈍頂螺旋藻869Spepc基因全長(zhǎng)為3108bp，多肽大小約為118kD，含有的主要氨基酸為L(zhǎng)eu、Glu，其次為Arg、Ser;其屬于原核型PEPC，一級(jí)結(jié)構(gòu)高度保守，在二級(jí)結(jié)構(gòu)上與高等植物極其相似。
　　 (2)構(gòu)建了反義pepc載體pEGFP-recA-p1（針對(duì)起始序列）和pEGF

4、P-recA-p2（針對(duì)保守序列），并在大腸桿菌DH5α中進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果表明含pEGFP-recA-p2質(zhì)粒的菌株與野生菌相比PEPC的酶比活力下降了約37%，總蛋白量減少了11.6%，總脂含量增加了4.5%，總蛋白/總脂含量比降低了約3倍。而含pEGFP-recA-p1質(zhì)粒的菌株與野生菌相比均差別不大。這表明針對(duì)保守序列設(shè)計(jì)的反義RNA載體更具有通用性。
　　 (3)對(duì)螺旋藻基因整合轉(zhuǎn)化平臺(tái)進(jìn)行了改進(jìn)，在轉(zhuǎn)化載體上添加了

5、GFP標(biāo)簽。利用超聲轉(zhuǎn)化法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，成功地在螺旋藻中實(shí)現(xiàn)了GFP的持續(xù)表達(dá)。
　　 (4)對(duì)螺旋藻轉(zhuǎn)化篩選的培養(yǎng)抗性濃度進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，在液體培養(yǎng)時(shí)選用100μg/mLAmp和30μg/mLG418可以很好的抑制野生藻的生長(zhǎng)，而在固體平板上則需要200μg/mLAmp和60μg/mLG418。
　　 (5)通過抗性篩選和GFP熒光觀察，采用微吸管分離法與多次超聲處理相結(jié)合成功篩選到三株較純的轉(zhuǎn)化藻株，但是轉(zhuǎn)化藻藻株

6、在形態(tài)上與野生藻有很大區(qū)別。通過比對(duì)野生藻和轉(zhuǎn)化藻熒光光譜學(xué)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化藻藻株的藻膽體由于某種原因發(fā)生缺失，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化藻呈無色，生長(zhǎng)緩慢，無法取得一定量的藻體以測(cè)定藻細(xì)胞油脂含量的變化。
　　 總之，本研究雖然獲得了轉(zhuǎn)基因螺旋藻，但由于其生長(zhǎng)受抑制，即使其油脂含量高也不適合進(jìn)行將來的生物質(zhì)能源開發(fā)。通過大腸桿菌的反義研究表明PEPC的抑制確實(shí)能提高其油脂含量，下一步的改進(jìn)工作將圍繞如何將反義基因?qū)肼菪迦旧w而不影響其生長(zhǎng)，這