His標(biāo)簽的人白細(xì)胞介素-2突變體在巴斯德畢赤酵母中的表達(dá)及純化研究.pdf

1、白細(xì)胞介素-2(interleukin2，IL-2)是白細(xì)胞介素家庭中的重要成員之一，分子量大約為15KD。它能夠促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生TNF α，IFN γ和GM-CSF等多種細(xì)胞因子；促進(jìn)B細(xì)胞分化及分泌抗體，在機(jī)體的免疫反應(yīng)中具有十分重要的調(diào)節(jié)作用，是一種重要的免疫調(diào)節(jié)核心物質(zhì)，在抗病毒、病原微生物感染及抗腫瘤等疾病治療中有著廣泛的應(yīng)用。本論文研究對(duì)象為三突變體人白細(xì)胞介素-2(編碼125位半胱氨酸→丙氨酸；

2、18位亮氨酸→蛋氨酸；19位亮氨酸→絲氨酸)，取得的主要研究結(jié)果如下： 采用PCR技術(shù)擴(kuò)增出IL-2突變體基因，并在基因序列3’端引入His6，將其克隆到表達(dá)載體pPIC9K中，成功構(gòu)建真核融合表達(dá)載體pPIC9K-IL-2，電激法轉(zhuǎn)化入巴斯德畢赤酵母GS115，采用G418抗性梯度法篩選，小量表達(dá)后經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)得到高拷貝高表達(dá)工程菌株。 從發(fā)酵時(shí)間、pH值、甲醇補(bǔ)加量三個(gè)方面對(duì)重組基因工程菌的發(fā)酵條件

3、在搖床水平上進(jìn)行了初步的優(yōu)化，獲得了一個(gè)較優(yōu)的發(fā)酵表達(dá)條件：發(fā)酵液初始pH6.0，甲醇誘導(dǎo)濃度為0.5％，誘導(dǎo)72小時(shí)；在上述條件下目的蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白的30％以上，目的蛋白的分泌量大約為32mg/L。對(duì)酵母工程菌進(jìn)行大量表達(dá)，通過(guò)甲醇誘導(dǎo)分泌型表達(dá)重組的帶His-tag的MvhIL-2蛋白。經(jīng)離心、超濾濃縮后，采用Ni2+親和層析對(duì)重組蛋白純化，蛋白純度為98.6％，電泳檢測(cè)只有一條帶。實(shí)驗(yàn)還利用Western-Blottin